(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210220057.7 (22)申请日 2022.03.08 (71)申请人 绍兴博英诊断技 术有限公司 地址 312000 浙江省绍兴 市诸暨市陶朱街 道聚力路16号 一号楼2层206室 申请人 浙江大学 (72)发明人 吴志英　董毅　杨寒霖　金芬芬　 马越　 (51)Int.Cl. C12Q 1/6883(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种检测肝豆状核变性基因高频突变的引 物组合及试剂盒 (57)摘要 本发明提供了一种检测肝豆状核变性基因 高频突变的引物组合及试剂盒， 涉及基因检测技 术领域。 本发明选取ATP7B基因的p.R778L， p.P992L和p.T9 35M三个高频突变位点， 根据四引 物扩增受阻体系， 针对每个检测位点分别设置四 条引物， 其中两条为延伸方向相反的内引物， 两 条内引物的3 ’末端碱基分别 与其所检测的SNP位 点的一个碱基相同(或互补)， 另外两条为延伸方 向相反的外引物。 每个检测位点的四条引物均可 以组成三个引物对， 三个检测位点的全部引物在 同一个扩增体系内进行反应， 扩增产物用毛细管 电泳进行检测， 检测 结果用GeneMapper  ID‑X分 析。 本发明提供的引物组合及试剂盒能同时检测 三个SNP位点， 检测成本低， 周期短， 操作 简单， 准 确度高， 检测结果 易判读， 特异性高， 实用性强。 权利要求书1页 说明书10页 序列表5页 附图7页 CN 114438198 A 2022.05.06 CN 114438198 A 1.一种检测肝豆状核变性基因高频突变的引物组合， 其特征在于， 包括第 一引物组、 第 二引物组和第三引物组； 所述第一引物组由第一正常外引物、 第一正常内引物、 第一突变内引物和第一突变外 引物组成， 所述第一正常外引物、 第一正常内引物、 第一突变内引物和第一突变外引物的核 苷酸序列依次如SEQ  ID NO.1～SEQ  ID NO.4所示； 所述第一引物组用于检测ATP7B基因的 p.R778L位点； 所述第二引物组由第二正常外引物、 第二正常内引物、 第二突变内引物和第二突变外 引物组成； 所述第二正常外引物、 第二正常内引物、 第二突变内引物和第二突变外引物的核 苷酸序列依次如SEQ  ID NO.5～SEQ  ID NO.8所示； 所述第二引物组用于检测ATP7B基因 p.P992L位点； 所述第三引物组由第三正常外引物、 第三正常内引物、 第三突变内引物和第三突变外 引物组成； 所述第三正常外引物、 第三正常内引物、 第三突变内引物和第三突变外引物的核 苷酸序列依次如SEQ  ID NO.9～SEQ  ID NO.12所示； 所述第三引物组用于检测ATP7B基因 p.T935M位点。 2.根据权利要求1所述的引物组合， 其特征在于， 所述第一引物组、 第二引物组和第三 引物组中的每条引物的Tm值独立 地为58～62℃。 3.根据权利要求1所述的引物组合， 其特征在于， 所述第一正常外引物、 第二正常外引 物、 第三正常外引物的5 ’端标记有荧光素， 所述荧光素为FAM、 HEX、 TAMRE， 其中， FAM标记 p.R778L位点、 HEX标记p.P9 92L位点、 TAMRE标记p.T93 5M位点。 4.根据权利要求1～3任意一项所述的引物 组合， 其特征在于， 所述第 一突变内引物、 第 二突变内引物、 第三 突变内引物的3 ’末端的‑3位引入错配碱基。 5.一种用于检测肝豆状核变性基因高频突变的试剂 盒， 其特征在于， 包括权利要求1～ 4任意一项所述的引物组合。 6.根据权利要求5所述的试剂盒， 其特 征在于， 还 包括ROX‑500分子量内标。 7.根据权利要求5所述的试剂盒， 其特 征在于， 所述试剂盒包括： 8.根据权利要求7所述的试剂盒， 其特征在于， 所述2 ×Buffer Mix包括： 1.5mM硫酸铵、 1.5mM镁离子、 0.2mM  dNTPs、 20mM氯化钾、 0.3mg/ml  BSA、 6％DMSO、 50mM甜菜碱、 35nM  Tris‑ HCL、 0.8U Taq DNA聚合酶、 0.2U  UNG酶。 9.根据权利要求7所述的试剂盒， 其特征在于， 所述引物Mix中SEQ  ID NO.1～SEQ  ID  NO.4的浓度均为0.052 μM， SEQ  ID NO.5～SEQ  ID NO.8的浓度均为0.163 μM， SEQ  ID NO.9～ SEQ ID NO.12的浓度均为0.468 μM 。 10.根据权利 要求7所述的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒用于PCR扩增， 所述PCR的反 应条件为： 50℃孵育5min； 98℃变性3min； 94℃变性10S， 62℃退火30S， 28个循环； 72℃延伸 5min。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114438198 A 2一种检测肝豆 状核变性基因高 频突变的引物组合及 试剂盒 技术领域 [0001]本发明涉及基 因检测技术领域， 特别涉及检测肝豆状核变性基因高频突变的引物 组合及试剂盒。 背景技术 [0002]肝豆状核变性又称Wilson病， 是一种以铜代谢障碍为特征的常染色体单基因隐性 遗传疾病， 病变主要累及肝脏、 脑、 肾脏和角膜等部位， 引起进 行性加重的肝硬化、 基底节损 害、 肾脏损害及角膜色素环等。 肝豆状核变性由ATP7B基因突变引起， 该基因编码铜转运P型 ATP酶(copper ‑transporting  P‑type ATPase， ATP7B)。 ATP7B基因突变以高频突变伴随广 泛存在的罕见突变为特征， 具有明显的地域及种族分布特征。 ATP7B是一种表达在 多器官的 膜蛋白， 主要功能是促进铜随血液及胆汁排泄。 当ATP7B基因发生突变时， ATP7B在细胞内的 定位发生改变， 其转运铜能力下降， 引起血清铜蓝蛋白合成减少、 胆管排铜受阻。 过量的铜 蓄积在体内， 引起细胞坏死和 器官损害， 后期严重影响患者的生活质量， 最终可引起死亡。 目前， 肝豆状核变性的诊断主要依靠典型的临床表现、 实验室检查及基因检测， 治疗包括青 霉胺、 锌制剂和 肝移植等。 早期诊断和 早期干预对于延缓疾病的进展和预防不可逆的后遗 症至关重要。 [0003]目前， 国内外用于SNP基因突变的检测方法主要有： 聚合酶链反应  (PCR)分析技 术、 变性高效液相色谱(DHPLC)分析技术、 DNA测序技术、 DNA微阵列技术、 高分辨率溶解曲线 分析(HRM)、 Taqman探针技术等。 多重扩增阻滞突变系统PCR(multiplex  amplification   refractory  mutation system  PCR， M‑ARMS‑PCR)是聚合酶链反应分析技术的一种， ARMS自   1989年问世以来已被用来检测多种基因的已知点突变， 其原理是PCR扩增时引物是否能延 伸主要取决于引物3 ’端的1～2个碱基是否与模板配对， 如果不配对则引物不能延伸， 故只 要能设计适当的引物， 则可以区别正常和突变的DNA序列。 在ARMS基础上设计多重P CR， 可同 时检测多种突变。 目前， 已有将ARMS技术应用于肝豆状核变性的突变基因检测中， 但检测位 点、 准确度、 重复性、 灵敏度等尚有 待进一步探讨， 无法满足临床的应用。 发明内容 [0004]有鉴于此， 本发明目的在于提供一种检测肝豆状核变性基 因高频突变的引物组合 及试剂盒， 本发明提供的引物组合及试剂盒能同时检测三个SNP位点， 检测成本低， 周期短， 操作简单， 准确度高， 具有较好的特异性， 能够满足临床的应用。 [0005]为了实现上述目的， 本发明提供以下技 术方案： [0006]一种检测肝豆状核变性基因高频突变的引 物组合， 包括第一引 物组、 第二引 物组 和第三引物组； [0007]所述第一引 物组由第一正常外引 物、 第一正常内引 物、 第一突变内引 物和第一突 变外引物组成， 所述第一正常外引物、 第一正常内引物、 第一突变内引物和第一突变外引物 的核苷酸序列依次如SEQ  ID NO.1～SEQ  ID NO.4 所示； 所述第一引物组用于检测ATP7B基说　明　书 1/10 页 3 CN 114438198 A 3