(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210227612.9 (22)申请日 2022.03.08 (71)申请人 山东省农业科 学院 地址 250131 山东省济南市历城区工业北 路202号 (72)发明人 王振宝　杨妍妍　刘冰江　霍雨猛　 徐宏志　孙亚玲　李艳伟　吴雄　 (74)专利代理 机构 济南圣达知识产权代理有限 公司 372 21 专利代理师 李筝 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种区分紫皮和黄皮洋葱的cDNA分子标记 及其应用 (57)摘要 本发明涉及一种区分紫皮和黄皮洋葱的 cDNA分子标记及其应用。 本发明根据洋 葱花青素 合成酶基因序列设计引物， 以30天苗龄紫皮、 黄 皮洋葱假茎为试材， 提取总RNA， 再反转录成 cDNA， 以Actin基因为对照进行花青素合成酶基 因的差异表达分析， 开发了区分紫皮和黄皮洋葱 的cDNA分子 标记， 利用得到的cDNA分子标记能够 快速、 准确的区分紫皮和黄皮洋葱。 并利用其它 紫皮、 黄皮洋葱品种对这一标记进行了验证。 本 发明获得了区分紫皮和黄皮洋葱的cDNA分子标 记， 可以应用于洋葱种子纯度鉴定， 与传统种子 纯度鉴定法相比， 能快速、 准确区分紫皮和黄皮 洋葱， 具有较大的商业应用价值， 也可 以应用于 洋葱种质资源鉴定和辅助育种方面。 权利要求书1页 说明书6页 序列表2页 附图1页 CN 114525361 A 2022.05.24 CN 114525361 A 1.一种区分紫皮和黄皮洋葱的cDNA分子标记， 其特征在于， 所述cDNA分子标记长度为 390bp， 其序列如SEQ  ID NO.1所示。 2.如权利要求1所述区分紫皮和黄皮洋葱的cDNA分子标记， 其特征在于， 所述紫皮洋葱 包括但不限于天正201、 赤玉3号、 早生紫丰、 紫玲、 改良赤玉品种； 所述黄 皮洋葱包括但不限 于天正10 5、 黄金大玉葱、 红叶3号、 地球、 早黄金品种。 3.一种区分紫皮和黄皮洋葱的引物， 其特 征在于， 所述引物序列如下： 正向引物 ANS‑F： 5′ ‑CTAACGATCAATCTAAAGGGA‑3′； 反向引物 ANS‑R： 5′ ‑GCAGTATGA ACGATAAGGCAC‑3′。 4.一种用于区分紫皮和黄皮洋葱的试剂组合， 所述试剂组合中包括权利要求3所述的 引物。 5.权利要求1所述cDNA分子标记、 权利要求3所述引物和/或权利 要求4所述试剂组合在 洋葱种质资源鉴定和辅助育种方面的应用。 6.如权利要求5所述cDNA分子标记、 引物和/或试剂组合在洋葱种质资源鉴定和辅助育 种方面的应用， 其特 征在于， 所述应用至少包括以下两方面： (1)将所述权利要求3所述引物和/或权利要求4所述试剂组合用于制备鉴别洋葱皮色 的产品； (2)通过权利 要求1或2所述cDNA分子标记、 权利要求3所述引物和/或权利要求4所述试 剂组合对洋葱种子的纯度进行鉴定 。 7.一种用于区分紫皮和黄皮洋葱的试剂 盒， 其特征在于， 所述试剂 盒中包括权利要求3 所述引物和/或权利要求 4所述试剂组合。 8.如权利要求7所述用于区分紫皮和黄皮洋葱的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒中， 还包括对照基因扩增引物； 所述对照基因的一种实例如Act in基因， 所述对照基因的扩增引 物序列如下： 上游引物 Actin‑F： 5′ ‑ACACGGCCTGGATAGCAACAT‑3′； 下游引物 Actin‑R： 5′ ‑AGAGCAGTAT TCCCAAGCATT‑3′。 9.如权利要求7所述用于区分紫皮和黄皮洋葱的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒中， 还包括洋葱总RNA提取 试剂及反转录试剂； 或， 所述试剂盒中， 还 包括PCR反应扩增体系。 10.一种洋葱品种鉴别方法， 其特征在于， 所述方法包括以下步骤： 提取洋葱总RNA， 经 反转录获得cDNA， 利用权利要求3所述引物对 上述cDNA进 行PCR扩增； 若权利要求3所述引物 不能扩增得到特异性条带， 则判断为黄皮洋葱； 若扩增后能够获得长度为390bp的条带， 则 判断为紫皮洋葱。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114525361 A 2一种区分紫皮和黄皮洋葱的cDNA分子标记及其应用 技术领域 [0001]本发明属于作物分子育种技术领域， 具体涉及一种区分紫皮和黄皮洋葱的cD NA分 子标记及其在洋葱种质资源鉴定和辅助育种方面的应用。 背景技术 [0002]公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解， 而不必然 被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技 术。 [0003]洋葱(Allium  cepa.L)， 别名球葱、 圆葱、 玉葱、 葱头、 皮牙子等， 百合科葱属二年生 草本植物， 是一种世界性蔬菜， 至少有175个国家栽培洋葱。 洋葱于近代传入我国， 由于具有 适应性强， 耐贮藏和运输的特点， 在我国广泛栽培， 是一种重要的出 口创汇蔬菜。 我国具有 世界最大 的洋葱生产面积和产量， 生产面积和总产量约占全世界的30％。 洋葱以肉质鳞茎 为主要食用器官， 营养物质丰富， 不仅可以鲜食， 也可以用于加工， 有 “蔬菜皇后 ”的美誉。 洋 葱中含有的类黄酮、 槲皮素、 有机硫等具有重要的生物和药用保健价值， 有抗氧化、 抗衰 老、 降血糖血脂、 降低血栓形成、 消炎、 防癌等作用。 [0004]洋葱为两年生蔬菜， 在中日照生态区一般7月初采种结束， 经过一个多月的清理、 晾晒、 包装、 销售， 最后进入种植户手中。 洋葱种植具有严格的播种育苗时间， 中日照生态区 需要在9月中上旬播种育苗， 而现有的形态学检测技术手段还不能在2个月内准确检区分不 同皮色的洋葱种子。 在洋葱种子生产过程中， 由于亲本不完全纯合、 群体自然分离、 机械混 杂等因素会造成种子纯度不合格。 为了避免因种子纯度不合格带来的风险， 种子生产企业 要将新采收的洋葱种子在仓库储存一年， 采取传统田间种植法来检测种子纯度。 在种子储 藏过程中， 不仅给经销商带来较大 的库存周转压力， 种子的发芽率和发芽势均会出现一定 程度的降低。 [0005]种子纯度检验技术已经由外观形态发展到生理生化水平和分子水平上的检测， 检 验方法有生理生化指标检测法、 蛋白质电泳技术检测法和分子标记技术检测法， 能够快速、 准确鉴定种子纯度。 关于通过生物技术手段检测洋葱种子纯度的研究较少， 茹鲜(茹鲜,王 建华,孙群.洋葱幼苗形态快速鉴定技术研究， 园林园艺科学,2003,19(6):190 ‑191)通过采 用不同光质培养与幼苗叶绿素测定的方法， 可以鉴定白皮洋葱与有色洋葱种子， 但无法有 效的区分紫皮洋葱与黄 皮洋葱。 张彦萍(张彦萍,刘海河,马德伟.利用种子 醇溶蛋白聚丙烯 酰胺凝胶电泳鉴定洋葱品种 类型,种子,2003,128(2):16,20)利用种子醇溶蛋白聚丙烯酰 胺凝胶电泳鉴定洋葱品种类型， 可以区分长日型与短日型洋葱， 但是无法区分相同日照类 型的不同皮色的洋葱。 分子标记技术检验法是利用品种间形态和 生化上的区别， 归根结底 是品种间在基因上 的区别， 分子标记技术是通过开发与品种 特性相连锁的分子标记， 对基 因序列的差异进行分析， 从而鉴定不同品种， 达到检测种子纯度的目的， 其检测对象是种子 或幼苗的基因片段， 不受环境的影响， 具有较高的准确性、 稳定性和重复性， 能快速、 准确的 鉴定种子纯度。说　明　书 1/6 页 3 CN 114525361 A 3