(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210220381.9 (22)申请日 2022.03.08 (71)申请人 苏州大学附属儿童医院 地址 215000 江苏省苏州市工业园区钟南 街92号 (72)发明人 郭万亮　黄顺根　汪健　赵廉　 贾慧惠　 (74)专利代理 机构 北京品源专利代理有限公司 11332 专利代理师 王艳斋 (51)Int.Cl. C12Q 1/6883(2018.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种与儿童急性肠套叠相关的生物标志物 及其应用 (57)摘要 本发明涉及一种与儿童急性肠套叠相关的 生物标志物及其应用。 所述与儿童急性肠套叠相 关的生物标志物包括tRF ‑Leu‑TAA‑006、 tRF ‑ Gln‑TTG‑033和tRF ‑Lys‑TTT‑028。 本发明利用分 子诊断技术， 首次采用高特异性的tRF ‑Leu‑TAA‑ 006、 tRF‑Gln‑TTG‑033和tRF ‑Lys‑TTT‑028作为 儿童急性肠套叠的生物标志物， 所采用的检测产 品， 不仅能够使得儿童急性肠 套叠的诊断符合特 异性强、 灵敏度高的要求， 还具有操作 简单快速、 无介入、 通 量高以及成本低等众多综合优势。 权利要求书1页 说明书8页 序列表2页 附图2页 CN 114540484 A 2022.05.27 CN 114540484 A 1.一种与儿童急性肠套叠相关的生物标志物， 其特征在于， 所述与儿童急性肠套叠相 关的生物标志 物包括tRF ‑Leu‑TAA‑006、 tRF‑Gln‑TTG‑033和tRF‑Lys‑TTT‑028。 2.如权利要求1所述的与儿童急性肠套叠相关的生物标志物的引物， 其特征在于， 所述 引物包括SEQ  ID NO.4～SEQ  ID NO.9所示的核酸序列。 3.如权利要求1所述的与儿童急性肠套叠相关的生物标志物或权利要求2所述的与儿 童急性肠套叠相关的生物标志物的引物在制备 儿童急性肠套叠的诊断和/或监测产品中的 应用。 4.一种儿童急性肠套叠诊断和/或监测试剂 盒， 其特征在于， 所述试剂 盒包括权利要求 2所述的与儿童急性肠套叠相关的生物标志 物的引物。 5.根据权利要求4所述的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒还包括RNA提取试剂、 逆转录 试剂或PCR  Mix中的任意 一种或至少两种的组合。 6.根据权利要求5所述的试剂盒， 其特征在于， 所述RNA提取试剂包括Trizol、 氯仿、 异 丙醇和乙醇； 优选地， 所述逆转录试剂包括逆转录反应液、 逆转录酶、 RNA酶抑制剂和dNTPs。 7.一种如权利要求4 ‑6任一项所述的儿童急性肠套叠诊断和/或监测试剂盒以非疾病 诊断和/或治疗为目的 的使用方法， 其特 征在于， 所述使用方法包括： 以样本中RNA为模板进行逆转录反应， 以所述逆转录反应的产物为模板， 利用权利要求 2所述的与儿童急性肠套叠相关的生物标志 物的引物进行实时荧 光定量PCR， 判读结果。 8.根据权利要求7所述的方法， 其特征在于， 所述使用方法还包括制备梯度稀释DNA模 板的步骤； 优选地， 所述梯度稀释DNA模板的制备 方法包括： 以所述逆转录反应的产物为模板， 利用权利要求2所述的与儿童急性肠套叠相关的生 物标志物的引物进行P CR反应， 将所述P CR反应产 物进行梯度稀释， 得到所述梯度稀释DNA模 板。 9.根据权利要求7或8所述的使用方法， 其特征在于， 实时荧光定量PCR的反应程序包 括： 预变性： 94～ 96℃， 8～1 1min； 循环延伸： 94～ 96℃变性9 ～11秒、 58～62℃延伸5 5～65秒并收集 荧光， 35～45个循环。 10.根据权利要求7 ‑9任一项所述的使用方法， 其特征在于， 所述使用方法包括以下步 骤： (1)提取样本中RNA， 并以所述RNA为模板进行逆转录反应， 得到 cDNA； (2)以所述cDNA为模板， 制备梯度稀释DNA模板； (3)分别以所述cDNA和梯度稀释DNA模板为模板， 利用权利要求2所述的与儿童急性肠 套叠相关的生物标志物的引物进行实时荧光定量PCR， 所述实时荧光定量PCR反应程序包 括： 预变性： 94～96℃， 8～11min； 循环延伸： 94～96℃变性9～11秒、 58～ 62℃延伸55～65秒 并收集荧光， 35～45个循环， 判读结果。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114540484 A 2一种与儿童急性肠套叠相关的生物标志物及其应用 技术领域 [0001]本发明属于基 因工程技术领域， 涉及一种与儿童急性肠套叠相关的生物标志物及 其应用， 尤其涉及 tRF‑Leu‑TAA‑006、 tRF‑Gln‑TTG‑033和tRF ‑Lys‑TTT‑028作为儿童急性肠 套叠生物标志 物。 背景技术 [0002]肠套叠是指肠管的一部分及其相应的肠系膜套入邻近肠腔内的一种肠梗阻， 分为 原发性和继发性两种。 婴幼儿肠套叠95％以上属于原发性肠套叠， 发生肠套叠的肠管没有 明显的器质性病变， 与婴幼儿时期回盲部系膜固定性差且活动度大等因素有关。 继发性肠 套叠多见于Meckel憩 室、 肠息肉、 肠道重复畸形、 淋巴瘤等。 原发性急性肠 套叠多见于2岁以 下婴幼儿， 男女之比约为2～3:1， 常突然发病， 典型 临床表现有阵发性哭闹、 渐进性腹痛、 呕 吐、 粘液血便和 腹部包块等， 严重者可导致高热、 脱水、 休克。 因此， 对于儿童急性肠套叠应 该早诊早治， 以防不良事 件发生。 [0003]目前， PBM的主要诊 断方法包括腹部B超、 钡灌肠X线检查、 腹部立位片等影像学手 段， 但由于肠道部位结构复杂性， 一旦临床确诊， 由肠套叠所致的肠管淤血、 缺血等病理改 变， 对肠管黏膜造成一定损伤， 因此需要寻求早期 筛查的分子标记物， 以便对临床前期肠套 叠高危患者进行早期诊断， 降低肠管及相关并发症。 [0004]分子诊断技术是指以D NA或RNA为诊断材料， 用分子生物学技术通过检测基因的存 在、 缺陷或表达异常， 从而对人体状态和疾病作出诊断的技术， 具有 特异性高、 检测周期短、 成本低、 准确度高等特点， 对 疾病的预防、 预测、 诊断、 治疗和预后具有重要意 义。 [0005]转运RNA(tRNA)是一种参与解码mRNA、 翻译蛋白质的接头分子， 近年来的研究表明 tRNA还能作为小非编码RNA(sncRNA)的主要来源之一， 具有独特且多样的功能。 这些tRNA来 源的ncRNA 并非随机降解的产物， 而是通过精确的生物发生过程产生的。 源自tRNA的ncRNA 大致分为两大类： tiRNA(或者tRNAhalves)和tRFs(tRNA衍 生片段) [0006]tRFs长度约16～28nt， 来源于成熟tRNA或前体tRNA， tRFs作为sncRNA执行多种生 物学功能包括能够作为miRNA行使RNA干扰； 替换与mRNA结合的翻译起始因子eIF4G， 直接抑 制蛋白的翻译 过程； 结合某些蛋白因子， 例如YBX1， 影 响mRNA的稳定性； 与细胞色素C相互作 用， 调控细胞凋亡； 在应激条件下促进应激颗粒的组装； 敏化细胞氧化应激诱导的p53激活 以及p53依赖的细胞 死亡； 作为父代 表观遗传因子， 改变子代基因转录级联 过程等。 [0007]然而， 现有技 术中尚未有记载tRFs与儿童急性肠套叠的发生相关。 发明内容 [0008]针对现有技术的不足和实际需求， 本发明提供一种与儿童急性肠套叠相关的生物 标志物及其应用， 本发明首次发现tRF ‑Leu‑TAA‑006、 tRF‑Gln‑TTG‑033和tRF ‑Lys‑TTT‑028 与儿童急性肠套叠的发生相关， 其在儿童急性肠套叠中表达明显高于正常对照组(P ‑ 0.05)， 因此， 可通过分析tRF ‑Leu‑TAA‑006、 tRF‑Gln‑TTG‑033和tRF ‑Lys‑TTT‑028的表达辅说　明　书 1/8 页 3 CN 114540484 A 3