(19)国家知识产权局 (12)发明 专利 (10)授权公告 号 (45)授权公告日 (21)申请 号 202210219172.2 (22)申请日 2022.03.08 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 114574617 A (43)申请公布日 2022.06.03 (73)专利权人 江南大学 地址 214122 江苏省无锡市通沙路898号 南 楼七层 (72)发明人 杨艳坤　吕梦娇　战春君　刘秀霞　 白仲虎　 (74)专利代理 机构 南京禹为知识产权代理事务 所(特殊普通 合伙) 32272 专利代理师 康伟 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/6851(2018.01)C12Q 1/04(2006.01) C12N 15/11(2006.01) (56)对比文件 CN 103882142 A,2014.0 6.25 CN 110982931 A,2020.04.10 CN 107043757 A,2017.08.15 A. Kuberl 等.登录号： FR8396 30.1. 《GenBan k》 .2016,第1- 6页. 郭晋霞等.荧 光定量PCR法检测重组毕赤酵 母工程菌的外源基因拷贝数. 《重庆理工大 学学 报 （自然科 学版） 》 .2016,第3 0卷(第2期),第7 7- 83页. 张儒等.GAP DH基因克隆及其作为毕赤酵母 内标物的可靠性研究. 《生物技 术通报》 .201 1, (第2期),第174-178页. 审查员 戴露丹 (54)发明名称 一种巴斯德毕赤酵母不同碳源下的内参基 因及其引物和应用 (57)摘要 本发明公开了一种巴斯德毕赤酵母不同碳 源下的内参基因及其引物和应用， 所述内参基因 为Eif5a基因和/或RPL14B基因。 本发明提供的内 参基因在巴斯德毕赤酵母不同碳源培养基中稳 定表达， 为蛋白生产过程中相关功能基因的表达 定量提供可靠的分析依据； 弥补了巴斯德毕赤酵 母实时荧光定量内参基因的缺失， 有利于菌株构 建工程和重组 蛋白生产， 为今后开展基因表达研 究提供了可靠依据。 权利要求书1页 说明书6页 序列表2页 附图4页 CN 114574617 B 2022.12.27 CN 114574617 B 1.RPL14B基因和Eif5a基因作为内参基因在巴斯德毕赤酵母不同碳源下的实时荧光定 量检测中的应用， 其特征在于： 所述 RPL14B基因的核苷酸序列如SEQ  ID NO.1所示， 所述 Eif5a基因的核苷酸序列如SEQ  ID NO.2所示。 2.用于扩增如权利要求1所述的内参基因 的引物在巴斯德毕赤酵母不同碳源下的实时 荧光定量检测中的应用， 其特征在于： 用于扩增 RPL14B基因的引物包括核苷酸序列如SEQ   ID NO.3所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ  ID NO.4所示的反向引物； 用于扩增 Eif5a基因的引物包括核苷酸序列如SEQ  ID NO.5所示的正向引物和核苷酸 序列如SEQ  ID NO.6所示的反向引物。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114574617 B 2一种巴斯 德毕赤酵母不同碳 源下的内参 基因及其引物和应用 技术领域 [0001]本发明属于分子生物学领域， 具体涉及到一种巴斯德毕赤酵母不同碳源下的内参 基因及其引物和应用。 背景技术 [0002]巴斯德毕赤酵母是一种单细胞真核微生物， 同时也是一种甲醇酵母， 被广泛用于 生产重组蛋白的宿主， 近年来作为生产化学品的细胞工厂备受关注， 具有严格调控的表达 系统， 与酿酒酵母相比糖基化更少， 在基础培养基中也可以实现高密度发酵， 生长速度快， 具有真核的翻译后修饰机制， 可以正确的表达、 分泌外源蛋白。 在重组巴斯德毕赤酵母的构 建过程中经常需要检测基因的表达水平。 [0003]目前， 实时荧光定量(Rev erse transcription quantitative  polymerase  chain  reα‑tubion， RT ‑qPCR)是最常用于检测基因转录水平的方法， 但它依赖于合适的内参基因 对功能基因的相对表达定量进 行数据标准化。 内参基因必须在特定的实验 条件下满足稳定 表达的要求。 以往的研究表明， 没有一种 单一的内参基因可以用于归一化所有的实验条件 或者物种。 迄今为止， ACT1基因是仅有的在巴斯德毕赤酵母中广泛应用于实时荧光定量的 内参基因。 在海滨雀稗中对MT2a,PIP1,VP1,和Cor413等基因的表达模式用实时荧光定量进 行检测。 结果表明， 使用稳定的和 不稳定的内参基因进行归一化会导致 目的基因的表达水 平存在显著差异， 这会引起实验结果的误 解。 [0004]巴斯德毕赤酵母用于构建细胞工厂时， 需要检测不同碳源培养基中目的基因的转 录情况， 目前， 还没有巴斯德毕赤酵母在不同碳源培养基中表达量稳定的内参基因的研究 报道， 这不利于使用实时荧 光定量方法研究重组巴斯德毕赤酵母中功能基因的表达情况。 发明内容 [0005]本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施 例。 在本部 分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部 分、 说明书摘要和发明名称的目的模糊， 而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。 [0006]鉴于上述和/或现有技 术中存在的问题， 提出了 本发明。 [0007]本发明的其中一个目的是提供一种巴斯德毕赤酵母不同碳源下的内参基 因， 所述 实时荧光定量内参基因在巴斯德毕赤酵母不同碳源培养基中稳定表达， 为蛋白生产过程中 相关功能基因的表达 定量提供可靠的分析依据。 [0008]为解决上述技术问题， 本发明提供了如下技术方案： 一种巴斯德毕赤酵母不 同碳 源下的内参基因， 所述内参基因为RPL14B基因和/或Eif5a基因。 [0009]作为本发明所述内参基因的一种优选方案， 其中： 所述RPL14B基因的核苷酸序列 如SEQ ID NO.1所示。 [0010]作为本发明所述内参基因的一种优选方案， 其中： 所述Eif5a基因的核苷酸序列如 SEQ ID NO.2所示。说　明　书 1/6 页 3 CN 114574617 B 3