(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210227613.3 (22)申请日 2022.03.08 (71)申请人 深圳闪量科技有限公司 地址 518057 广东省深圳市光明区凤 凰街 道凤凰社区观光路招商局光明科技园 A3栋C705.B6栋4C.B5栋A201 (72)发明人 莫茜　陶悦　林协　安亦泰　戴珩　 岳敏　 (74)专利代理 机构 上海十蕙一兰知识产权代理 有限公司 313 31 专利代理师 刘秋兰 (51)Int.Cl. C12Q 1/6851(2018.01) C12Q 1/70(2006.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 基于二十重PCR的多种呼吸道病原体核酸同 时检测用引物组及试剂盒 (57)摘要 本发明公开一种基于二十重PCR的多种呼吸 道病原体核酸同时检测用引物组及试剂盒， 试剂 盒包括甲型流感病毒(FluA)、 乙型流感病毒 (FluB)、 呼吸道合胞病毒(RSV)、 人副流感病毒 (hPIV)、 肺炎支原体(MP)、 新型冠状病毒(SARS ‑ CoV‑2)、 人呼吸道腺病毒(HADV)、 人呼吸道鼻/肠 病毒(HRV/HEV)及百日咳杆菌(BP)的正向引 物、 反向引物以及淬灭探针。 本发明的多种呼吸道病 原体核酸同时检测用试剂盒保持高特异性的同 时显著提高检测的灵敏度， 同时配合全封闭的样 本处理到扩增一体化的全自动检测卡盒， 适用于 对呼吸道病原体的快速 检测。 权利要求书3页 说明书12页 序列表14页 附图5页 CN 114934102 A 2022.08.23 CN 114934102 A 1.一种多种呼吸道病原体核酸同时检测用引物组， 其特 征在于包括如下引物对： FluA‑F正向引物、 FluA ‑R反向引物， FluB ‑F正向引物、 FluB ‑R反向引物， RSVA ‑F正向引 物、 RSVA‑R反向引物， RSVB ‑F正向引物、 RSVB ‑R反向引物， hPIV1 ‑F正向引物、 hPIV1 ‑R反向引 物， hPIV2 ‑F正向引物、 hPIV2 ‑R反向引物， hPIV3 ‑F正向引物、 hPIV3 ‑R反向引物， hPIV4 ‑F正 向引物、 hPIV4 ‑R反向引物， MP ‑F正向引物、 MP ‑R反向引物， SARS ‑CoV‑2‑ORF正向引物、 SARS ‑ CoV‑2‑ORF反向引物， SA RS‑CoV‑2‑N正向引物、 SA RS‑CoV‑2‑N反向引物， SA RS‑CoV‑2‑E正向 引物、 SARS ‑CoV‑2‑E反向引物， HADV ‑F正向引物、 HADV ‑R1反向引物、 HADV ‑R2反向引物、 HADV‑R3反向引物、 HADV ‑R4反向引物， HRV /HEV‑F正向引物、 HRV /HEV‑R反向引物， 和， BP ‑F正 向引物、 BP ‑R反向引物。 2.如权利要求1所述的多种呼吸道病原体核酸同时检测用引物组， 其特征在于还包括 如下淬灭探针： FluA ‑P淬灭探针、 FluB ‑P淬灭探针、 RSVA ‑P淬灭探针、 RSVB ‑P淬灭探针、 hPIV1‑P淬灭探针、 hPIV2 ‑P淬灭探针、 hPIV3 ‑P淬灭探针、 hPIV4 ‑P淬灭探针、 MP ‑P淬灭探针、 SARS‑CoV‑2‑ORF淬灭探针、 SARS ‑CoV‑2‑N淬灭探针、 SARS ‑CoV‑2‑E淬灭探针、 HADV ‑P淬灭探 针、 HRV/HEV‑P淬灭探针和BP ‑P淬灭探针。 3.如权利要求2所述的多种呼吸道病原体核酸同时检测用引物组， 其特征在于还包括 如下引物组和淬灭探针： RP ‑F正向引物、 RP ‑R反向引物和RP ‑P淬灭探针。 4.如权利要求1所述的多种呼吸道病原体核酸同时检测用引物组， 其特征在于具体包 括如下引物对： 如SEQ ID NO:1所示的FluA ‑F正向引物， 如SEQ  ID NO:2所示的FluA ‑R反向引物； 如SEQ ID NO:4所示的FluB ‑F正向引物， 如SEQ  ID NO:5所示的FluB ‑R反向引物； 如SEQ ID NO:7所示的RSV A‑F正向引物， 如SEQ  ID NO:8所示的RSV A‑R反向引物； 如SEQ ID NO:10所示的RSVB ‑F正向引物， 如SEQ  ID NO:11所示的RSVB ‑R反向引物； 如SEQ ID NO:13所示的hPIV1 ‑F正向引物， 如SEQ  ID NO:14所示的hPIV1 ‑R反向引物； 如SEQ ID NO:16所示的hPIV 2‑F正向引物， 如SEQ  ID NO:17所示的hPIV 2‑R反向引物； 如SEQ ID NO:19所示的hPIV3 ‑F正向引物， 如SEQ  ID NO:20所示的hPIV3 ‑R反向引物； 如SEQ ID NO:22所示的hPIV4 ‑F正向引物， 如SEQ  ID NO:23所示的hPIV4 ‑R反向引物； 如SEQ ID NO:25所示的MP ‑F正向引物， 如SEQ  ID NO:26所示的MP ‑R反向引物； 如SEQ ID NO:28所示的SARS ‑CoV‑2‑ORF‑F正向引物， 如SEQ  ID NO:29所示的SARS ‑ CoV‑2‑ORF‑R反向引物； 如SEQ ID NO:31所示的SARS ‑CoV‑2‑N‑F正向引物， 如SEQ  ID NO:32所示的SARS ‑CoV‑ 2‑N‑R反向引物； 如SEQ ID NO:34所示的SARS ‑CoV‑2‑E‑F正向引物， 如SEQ  ID NO:35所示的SARS ‑CoV‑ 2‑E‑R反向引物； 如SEQ ID NO:37所示的HADV ‑F正向引物， 如SEQ  ID NO:38所示的HADV ‑R1反向引物， SEQ ID NO:39所示的HADV ‑R2反向引物， SEQ  ID NO:40所示的HADV ‑R3反向引物， SEQ  ID  NO:41所示的HADV ‑R4反向引物； 如SEQ ID NO:43所示的HRV/HEV ‑F正向引物， 如SEQ  ID NO:44所示的HRV/HEV ‑R1反向 引物； 如SEQ  ID NO:45所示的HRV/HEV ‑R2反向引物； 如SEQ  ID NO:46所示的HRV/HEV ‑R3反 向引物； 如SEQ  ID NO:47所示的HRV/ HEV‑R4反向引物；权　利　要　求　书 1/3 页 2 CN 114934102 A 2如SEQ ID NO:49所示的BP ‑F正向引物， 如SEQ  ID NO:50所示的BP ‑R反向引物。 5.如权利要求 4所述的多种呼吸道病原体核酸同时检测用引物组， 其特 征在于还 包括： 如SEQ ID NO:52所示的RP ‑F正向引物， 如SEQ  ID NO:53所示的RP ‑R反向引物。 6.如权利要求4或5所述的多种呼吸道病原体核酸同时检测用引物组， 其特征在于还包 括如下淬灭探针： 如SEQ ID NO:3所示的FluA ‑P淬灭探针； 如SEQ ID NO:6所示的FluB ‑P淬灭探针； 如SEQ ID NO:9所示的RSV A‑P淬灭探针； 如SEQ ID NO:12所示的RSVB ‑P淬灭探针； 如SEQ ID NO:15所示的hPIV1 ‑P淬灭探针； 如SEQ ID NO:18所示的hPIV 2‑P淬灭探针； 如SEQ ID NO:21所示的hPIV3 ‑P淬灭探针； 如SEQ ID NO:24所示的hPIV4 ‑P淬灭探针； 如SEQ ID NO:27所示的MP ‑P淬灭探针； 如SEQ ID NO:30所示的SARS ‑CoV‑2‑ORF‑P淬灭探针； 如SEQ ID NO:33所示的SARS ‑CoV‑2‑N‑P淬灭探针； 如SEQ ID NO:36所示的SARS ‑CoV‑2‑E‑P淬灭探针； 如SEQ ID NO:42所示的HADV ‑P淬灭探针； 如SEQ ID NO:48所示的HRV/ HEV‑P淬灭探针； 如SEQ ID NO:51所示的BP ‑P淬灭探针。 7.如权利要求6所述的多种呼吸道病原体核酸同时检测用引物组， 其特征在于还包括 如下淬灭探针： 如SEQ  ID NO:54所示的RP ‑P淬灭探针。 8.一种多种呼吸道病原体核酸同时检测用试剂盒， 其特征在于所述试剂盒包括： 权利 要求1～7任一项所述的引物组， 以及反应预混液。 9.如权利要求8所述的多种呼吸道病原体核酸同时检测用试剂盒， 其特征在于所述反 应预混液包括酶混合液、 核苷酸混合液、 二 价镁离子和缓存液。 10.如权利要求9所述的多种呼吸道病原体核酸同时检测用试剂盒， 其特征在于： 所述 酶混合液包括： 0.01～1IU/ μL优选0.01～0.1IU/ μL的耐热DNA聚合酶、 100 ‑400U/ μL的逆转 录酶、 30‑50U/ μL的RNA酶抑制剂； 所述核苷 酸混合液为三磷酸脱氧核糖核苷 酸， 浓度为10～ 500 μmol/L优选100～200 μmol/L； 二价镁离子选自氯化镁或硫酸镁， 浓度为1～4mmol/L优选 2.5～3.5mmol/L； 缓存液为pH＝8.0的Tris缓冲液； 各引物和各淬灭探针的浓度分别为10～ 500nmol/L优选10 0～200nmol/L。 11.如权利要求9所述的多种呼吸道病原体(20重PCR)核酸同时检测用试剂盒， 其特征 在于