(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210228164.4 (22)申请日 2022.03.08 (71)申请人 华南农业大 学 地址 510642 广东省广州市天河区五山路 483号 (72)发明人 肖立华　陈雪华　冯耀宇　郭亚琼　 李娜　 (74)专利代理 机构 广州粤高专利商标代理有限 公司 44102 专利代理师 赵崇杨 (51)Int.Cl. C12Q 1/6888(2018.01) C12Q 1/6848(2018.01) C12Q 1/6869(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种用于牛中常见艾美耳球虫检测和虫种 鉴定的巢式PCR方法及试剂盒 (57)摘要 本发明公开了一种用于牛中常见艾美耳球 虫检测和虫种鉴定的巢式PCR方法及试剂盒。 本 发明采用牛的艾美耳球虫SSU  rRNA基因作为检 测靶序列， 所述序列中具有保守区域和可变区 域， 相应扩增片段中包含多个单核苷多态性位 点； 本发明进 一步通过设计巢式PCR引物， 建立了 牛中常见艾美耳球虫巢式PCR检测方法， 可检测 出不同的牛中常见艾美耳球虫， 进行艾美耳球虫 的虫种鉴定。 采用本发明的检测方法能够最低检 测到一个卵囊， 其扩增效率高， 检测灵敏， 可以准 确区分牛感染的不同艾美耳球虫， 并确定引起发 病的不同虫种， 用于牛球虫病的精准防控。 权利要求书1页 说明书9页 序列表1页 附图3页 CN 114540508 A 2022.05.27 CN 114540508 A 1.一种用于牛中常见艾美耳球虫检测和虫种鉴定的PCR引物， 其特征在于， 所述引物设 计位点位于牛的艾美耳球虫SSU  rRNA高度保守区且其扩增片段中存在区分不同虫种的单 核苷酸多态性 位点。 2.根据权利要求1所述PCR引物， 其特征在于， 所述引物为巢式PCR引物， 包括第一轮PCR 上游引物Eimeria ‑F1、 第一轮PCR下游引物Eimeria ‑R1和第二轮PCR上游引物Eimeria ‑F2、 第二轮PCR下游引物Eimeria ‑R2， 其引物的核苷酸序列依次如SEQ  ID NO： 1～4所示。 3.权利要求1或2所述PCR引物在牛的艾美耳球虫检测 和虫种鉴定中的应用。 4.一种用于牛的艾美耳球虫检测 和虫种鉴定的方法， 其特 征在于， 包括如下步骤： S1.从待测粪便样品中提取DNA； S2.以步骤S1所述DNA为模板， 用权利要求1或2所述PCR引物进行PCR或巢式PCR扩增； S3.对步骤S2中扩增产物进行电泳检测， 其中只要扩增出一条条带即为阳性样本， 并把 阳性样本进行测序分析， 根据虫种特异 性单核苷酸多态性位点上的碱基序列来鉴定待测样 品的虫种。 5.根据权利要求4所述方法， 其特征在于， 所述巢式PCR第一轮扩增的反应体系为： 1μL   DNA、 25 μL 2×DreamTaq  PCR Master Mix、 1.25 μL第一轮PCR上游引物和下游引物、 2 μL牛血 清蛋白、 最后加 入去离子水至50 μL； 第二轮扩增的反应体系为： 2 μL第一轮PCR产物、 25 μL  2 ×DreamTaq  PCR Master Mix、 2 μL牛血清蛋白、 1.25 μL第二轮PCR上游引物和下游引物、 最 后加入去离 子水至50 μL。 6.根据权利要求4所述方法， 其特征在于， 所述巢式PCR第一轮与第二轮扩增程序相同 均为： 94℃预变性5分钟； 94℃变性45秒， 52℃退火30秒和68℃延伸30秒， 一共循环该过程45 次； 最后， 68℃延伸7分钟。 7.权利要求1或2所述引物在制备用于牛的艾美耳球虫检测和虫种鉴定试剂盒中的应 用。 8.一种用于牛中艾美耳球虫的检测和虫种鉴定的检测试剂盒， 其特征在于， 包含权利 要求1或2所述的PCR引物。 9.根据权利要求8所述检测试剂盒， 其特 征在于， 还 包含PCR所需试剂阳性和阴性对照。 10.根据权利要求8所述检测试剂盒， 其特征在于， 还包含从待测粪便样品中提取DNA所 需的试剂。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114540508 A 2一种用于牛中常见艾美耳球虫检测和虫种鉴定的巢式PCR方 法及试剂盒 技术领域 [0001]本发明属于分子生物学技术领域。 更具体地， 涉及一种用于牛中常见艾美耳球虫 检测和虫种鉴定的巢式PCR方法及试剂盒。 背景技术 [0002]艾美耳球虫(Eimeria)是牛科动物中常见的肠道寄生虫， 主要引起以急性肠炎和 血便为主的牛球虫病， 在2岁以内的犊牛感染率可高达到100％， 而且具有高致死率， 因此对 畜牧业危害严重。 目前， 在我国牛中已发现的艾美耳球虫有13种， 分别是椭圆艾美耳球虫 (E.ellipsoidali s)、 亚球形艾美 耳球虫(E.subsperica)、 邱氏艾美 耳球虫(E.zuernii)、 阿 拉巴马艾美耳球虫(E.alabamensis)、 牛艾美耳球虫(E.bovis)、 加拿大艾美耳球虫 (E.canadensis)、 柱状艾美耳球虫(E.cylindrica)、 奥博艾美耳球虫(E.auburnensis)、 怀 俄明艾美耳球虫(E.wyomingen sis)， 伊利诺斯艾美 耳球虫(E.illinoisen sis)、 巴西艾美 耳 球虫(E .brasiliensis)、 皮利他艾美耳球(E .pellita)和布克朗艾美耳球虫 (E.bukidnonensis)。 但是现今普遍认为牛艾美耳球虫和邱氏艾美耳球虫是对牛致病性最 强的两个艾美耳球虫虫种， 会引起肠道损伤， 导致严重腹泻， 甚至死亡。 除了这两种球虫外， 其他虫种是否具有致病性尚有争议。 所以亟需可以准确区分牛感染的不同艾美耳球虫虫种 的方法， 以确定引起发病的虫种， 同时也有助于牛球虫病的精准防控。 [0003]目前牛中常见艾美耳球虫的检测和虫种鉴定技术主要有两种， 分别是形态学观察 和PCR检测。 牛中常见的艾美耳球虫虫种在卵囊大小、 颜色和形状上具有一定差异， 其中部 分虫种通过形态学特征加以区分。 已有研究者对不同的艾美耳球虫的卵囊和子孢子的形态 学数据进 行了测量和统计， 为其他学者辨认鉴定虫种提供了重要参考。 但是， 基于形态学的 检测和鉴定具有一定的主观性， 易造成误判， 且通常需要样本中包含 大量卵囊， 检测灵敏度 低、 耗时长。 近年来， 有 学者建立了基于P CR的艾美耳球虫分子检测方法， 这些方法 几乎都是 以艾美耳球虫属特异性的核糖体RNA基因的内转录间隔区(Internal  Transcribed   Spacer， ITS)为目标扩增序列， 但不同艾美耳球虫的内转录间隔区的序列长度和多态性差 异较大。 因此采用艾美耳球虫属特异性的ITS通过PCR对不同虫种的扩增效率存在明显差 异， 因此采用同一扩增条件进行扩增时常导致无法对某些虫种有效扩增， 即导致假阴性出 现。 而且， 现有的艾美耳球虫ITS  PCR扩增均为单轮PCR， 检测灵敏度较低， 无法准确检测卵 囊量较低的样本， 并且易造成非特异性的扩增。 发明内容 [0004]本发明要解决的技术问题是克服上述问题的缺陷和不足， 提供一种用于牛中常见 艾美耳球虫检测 和虫种鉴定的巢式PCR方法及试剂盒。 [0005]本发明的第一个目的是提供一种用于牛中常见艾美耳球虫检测和虫种鉴定的PCR 引物。说　明　书 1/9 页 3 CN 114540508 A 3