(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210218922.4 (22)申请日 2022.03.08 (71)申请人 江西省农业科 学院水稻研究所 地址 330000 江西省南昌市青云谱区南 莲 路602号 申请人 中国科学院东北地理与农业 生态研 究所 (72)发明人 王记林　王电文　田春杰　陈红萍　 陈大洲　黄成　陈萍　邓伟　 (74)专利代理 机构 北京高沃 律师事务所 1 1569 专利代理师 薛红凡 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/6858(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种基于KASP技术用于水稻耐高温基因分 型的引物组、 检测试剂盒及其应用 (57)摘要 本发明提供了一种基于KASP技术用于水稻 耐高温基因分型的引物组、 检测试剂盒及其应 用， 属于分子生物学及作物遗传育种技术领域。 基于KASP技术用于水稻耐高温基因分型的引物 组包括扩增OsTT1的引物组、 扩增SLG1的引物组 和扩增SUS3的引物组。 本发明对OsTT1、 SLG1和 SUS3中SNP位点 设计引物， 通过筛选， 去除了引物 组合出现的错配、 发夹结构、 引物二聚体等情况， 获得的3组引物组可有效区分等位变异位点， 可 用于增强水稻耐高温能力。 采用所述引物组对16 份水稻材料进行3个耐高温基因有利等位变异分 析， 结果能够明显区分不同水稻种质3个耐高温 基因的基因型的检测， 为 耐高温水稻辅助育种提 供了新思路。 权利要求书1页 说明书10页 序列表6页 附图2页 CN 114480718 A 2022.05.13 CN 114480718 A 1.一种基于KASP技术用于水稻耐高温基因分型的引物组， 其特征在于， 包括扩增OsTT1 的引物组、 扩增SLG1的引物组和扩增SUS3的引物组； 所述扩增OsTT1的引物组包括核苷酸序列如SEQ  ID NO:1所示的第一正向引物、 核苷酸 序列如SEQ  ID NO:2所示的第二 正向引物和核苷酸序列如SEQ  ID NO:3所示的反向引物； 所述扩增SLG1的引物组包括核苷酸序列如SEQ  ID NO:4所示的第一正向引物、 核苷酸 序列如SEQ  ID NO:5所示的第二 正向引物和核苷酸序列如SEQ  ID NO:6所示的反向引物； 所述扩增SUS3 的引物组包括核苷酸序列如SEQ  ID NO:7所示的第一正向引物、 核苷酸 序列如SEQ  ID NO:8所示的第二 正向引物和核苷酸序列如SEQ  ID NO:9所示的反向引物； 第一正向引物和第二 正向引物采用不同标记 物修饰。 2.根据权利要求1所述引物组， 其特 征在于， 所述标记 物包括荧光基团或标签序列。 3.根据权利要求2所述引物组， 其特征在于， 3条第 一正向引物分别 采用FAM标签序列修 饰， 3条第二 正向引物分别采用H EX标签序列修饰； 所述FAM标签序列的核苷酸序列如SEQ  ID NO:10所示； 所述HEX标签序列如SEQ  ID NO:11所示。 4.一种用于水稻耐高温基因分型的检测试剂盒， 其特征在于， 包括权利要求1～3一项 所述引物组。 5.根据权利要求4所述检测试剂盒， 其特征在于， 所述检测试剂盒还包括2 ×KASP  MasterMix。 6.权利要求1～3任意一项所述引物组或权利要求4或5所述检测试剂盒在水稻耐高温 基因分型中的应用。 7.权利要求1～3任意一项所述引物组或权利要求4或5所述检测试剂盒在耐高温水稻 辅助育种中的应用。 8.一种水稻资源的耐高温基因型的分型 方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： 1)提取待检测水稻资源的基因 组DNA； 2)以步骤1)中提取的基因组DNA为模板， 采用权利要求1～3任意一项所述引物组进行 PCR扩增， 得到PCR扩增产物； 3)将步骤2)中所述PCR扩增产物进行 标记物检测， 获得3个片段对应的基因型。 9.根据权利要求8所述分型方法， 其特征在于， 所述PCR扩增的反应体系为5μl： 模板 DNA2.43 μl， 引物混合液0.07 μl， 2 ×ASP MasterMix  2.5 μl， 每条第 一正向引物或每条第二 正向引物的终浓度为12 μM， 每条反向引物的终浓度为25 μM 。 10.根据权利要求8或9所述分型方法， 其特征在于， 所述PCR扩增的反应程序为： 94℃ 15min； 94℃20s， 61℃ ～55℃梯度退火并延伸60s， 10个循环， 每个循环退火及延伸的温度降 低0.6℃； 94℃20s， 5 5℃60s， 32个循环。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114480718 A 2一种基于KASP技术用于水稻耐高 温基因分型的引物组、 检测 试剂盒及其应用 技术领域 [0001]本发明属于分子生物学及作物遗传育种技术领域， 具体涉及一种基于KASP 技术用 于水稻耐高温基因分型的引物组、 检测试剂盒及其应用。 背景技术 [0002]水稻(Oryza  sativa)是我国的主要粮食作物， 在国家粮食安全战略中占有主导地 位。 随着温室效应和极端异常天气的频繁出现， 高温热害已经成为影响水稻生产最重要因 素之一， 而长江中下游， 如江西的大部、 湖南的东部、 浙江的西南部、 四川的东部和广东的东 北部等地， 作为主要的水稻产区也成为高温热害的重灾区(郑建初等,2005)。 高温是严重影 响水稻的产量和品质， 不仅会导致花粉发育异常， 活力下降， 还会抑制颖花开放和花药开裂 程度， 阻碍传粉和受精， 造成结实率下降(MATSUI  et al.,2002,2005； TAO  et al.,2007； Zhang et al.,2007； RANG et al.,2011)。 特别是我国长江中下游稻区每年规律性的7月中 旬至8月下旬38℃以上极端高温， 而这段时间正好是双季早稻的灌浆期， 水稻灌浆期是产量 和米质形成的关键时期， 结果造成 “籽粒高温逼熟 ”， 导致秕粒率增加、 籽粒充实度下降、 产 量降低、 米质变劣， 给水稻生产造成严重损失。 因此， 开展水稻耐高温种质资源的筛选和水 稻品种的耐高温性精准鉴定， 以推动水稻耐高温性育种进程， 保障国家粮食安全已成为当 前水稻研究的一个重要课题。 [0003]水稻耐高温性是受多种遗传因素和环境共同调控的数量性状。 目前已克隆且存在 功能变异的水稻耐热性基因主要有OsTT1(LOC_Os03g26970)、 SLG1(LOC_Os12g39840)和 SUS3(LOC_Os07g42490)。 如OsTT1编码区存在3个单核苷酸多态性(single  nucleotide   polymorphism,SNP)位点， 其中SNP2位点1个G/A的变化导致其编码的蛋白第99个氨基酸由 精氨酸(Arg99)变为组氨酸(His99)， 而His99的替换可提高泛素化蛋白的降解效率， 从而提 高水稻的耐高温能力。 依据该单核苷酸多态性(single  nucleotide  polymorphism,SNP)可 将核心种质材料OsTT1分作两种单倍型， 二者存在极显著的耐高温性差异。 SLG1编码区存在 7个SNP位点， 其中第865位T/C和第1839位G/T的变化， 分别导致缬氨酸(Val)到丙氨酸(Ala) 和缬氨酸(Val)到苯丙氨 酸(Phe)的变化， 并引起 耐高温性差异。 这两个SNP在水稻核心种质 材料中紧密连锁， 利用这个两个SNP中的任意一个都可以将水稻核心种质分成两类， 且二者 在耐高温表型上存在极显著的差异。 利用导致基因功能变异的碱基位点开发标记， 筛选野 生稻中的有利等位变异， 为培育水稻耐高温品种具有重要意义。 然而， 传统的连锁标记主要 是基于与基因连锁的分子标记进 行基因型鉴定， 不能用来准确鉴定材料目标性状有利基因 单倍型组合以及 进行定向的改良育种， 并且操作复杂、 通量小、 劳动力消耗量大。 因此， 开 发 水稻重要耐高温基因标记， 利用基因标记辅助选择耐高温性较好的目标单株， 可以大大提 高选择效率， 加快育种进程。 [0004]分子标记技术能够有效的辅助优异基 因的选育， 但是现有的分子标记技术仍存在 许多不便利的因素。 常规的分子标记无法摆脱在完成聚合酶链式反应(Polymerase  说　明　书 1/10 页 3 CN 114480718 A 3