(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210225801.2 (22)申请日 2022.03.09 (71)申请人 中国动物卫 生与流行病学中心 地址 266032 山东省青岛市 市北区南京路 369号 (72)发明人 张浩博　樊晓旭　孙明军　刘蒙达　 田莉莉　孙翔翔　焉鑫　付树芳　 孙世雄　亓菲　刘婷婷　迟庆安　 冯淑芳　仵国政　张培培　魏润宇　 王毓秀　邵卫星　孙淑芳　范伟兴　 (74)专利代理 机构 北京识然知识产权代理事务 所(普通合伙) 11975 专利代理师 曾庆国 (51)Int.Cl. C12Q 1/689(2018.01)C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/32(2006.01) (54)发明名称 一种高灵敏度检测牛 结核病病原的方法 (57)摘要 本发明公开了一种微滴数字PCR法检测牛结 核病病原的引物、 探针及检测方法， 其中引物和 探针适用于微滴数字PCR法检测， 并且能够准确 地检测出牛分支杆菌核酸， 与猪链球菌、 沙门氏 菌、 金黄色葡萄球菌、 巴氏杆菌、 大肠杆菌、 苍白 念球菌、 布鲁氏菌样本核酸无交叉反应， 特异性 达100％； 检测方法灵敏、 准确， 利于检测潜伏感 染和低量感染， 本发明提供的基于微滴数字PCR 法高灵敏度检测牛结核病病原的方法， 可检测到 样本中单个 拷贝的牛分枝杆菌 。 权利要求书1页 说明书11页 序列表2页 附图3页 CN 114990238 A 2022.09.02 CN 114990238 A 1.一种检测牛结核病病原的基于微滴数字PCR方法扩增用的引物和探针， 其特征在于， 所述引物和探针用于检测序列为SEQ  ID NO:1的核酸片段。 2.如权利要求1所述的引物和探针， 其特征在于， 所述的引物中， 上游引物的序列为SEQ   ID NO:2， 下游引物的序列为SEQ  ID NO:3。 3.如权利要求1所述的引物和探针， 其特 征在于， 所述的探针的序列为SEQ  ID NO:4。 4.如权利要求3所述的引物和探针， 其特征在于， 所述的探针采用荧光报告基团和荧光 淬灭基团进行修饰。 5.如权利要求4所述的引物和探针， 其特征在于， 所述的荧光报告基团为FAM； 荧光淬灭 基团为BHQ1。 6.权利要求1 ‑5任一项所述的引物和探针在制备微 滴数字PCR检测试剂盒中的应用。 7.一种微滴数字PCR检测试剂盒， 其特征在于， 所述的试剂盒中包含有权利要求1 ‑5任 一项所述的引物和探针。 8.一种微滴数字PCR检测牛结核病病原的方法， 其特征在于， 所述的方法包括如下的步 骤： 1)提取待检测对象的核酸样品； 2)将微滴制备仪接通电源进行预热， 放入收集反应体系的8联管， 根据待检样品数， 在 控制电脑上选择相应孔道； 3)在15 μl  dPCR Mix反应缓冲液 中加入6 μl水， 浓度为10 μM的2.4 μl权利要求1所述的上 下游引物和10 μM的1.2 μl探针， 再加入3 μl步骤1)中得到的核酸样品， 充分混合， 得到水相反 应体系； 4)将微液滴生成芯片装入芯片适配件， 在水相溶液孔中加入30 μl步骤3)得到的水相反 应体系， 在油相溶液孔中加入180 μl微滴生成油， 盖上微滴生成密封盖， 放入微滴制备仪生 成微滴； 5)制备结束后， 将收集反应体系的8联管取出， 进行PCR反应， 反应条件为： 95℃109i9； 接着40个 循环， 94℃3 09， 55℃609； 12℃保持； 6)微滴检测仪接通电源进行预热， 将装有反应体系的8联管放入微液滴检测芯片适配 件中， 微液滴检测芯片放入适配件， 确保芯片将8联排管盖刺穿， 在芯片孔位加入检测试剂， 盖上微液滴检测芯片密封 垫盖， 放入微 滴检测仪中进行样本检测。 9.如权利 要求8所述的方法， 其特征在于， 所述的引物和探针的终浓度分别为3009M～1 μM和1509M～5009M； 优选上游引物和下游引物的终浓度为80 09M。 10.如权利要求8所述的方法， 其特 征在于， 所述的PCR反应温度为 49.3～63.4℃。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114990238 A 2一种高灵敏度检测牛结核病 病原的方 法 技术领域 [0001]本发明属于细 菌分子生物学检测技术领域， 具体涉及一种基于微滴数字  PCR检测 牛结核病病原的引物、 探针及检测方法。 背景技术 [0002]牛结核病(Bovine  Tuberculosis)是主要由牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis) 引起的人兽共患传染病， 其他结核分枝杆菌复合群病原， 如人结核分枝 杆菌、 田鼠分枝杆菌 和山羊分枝杆菌等对牛也具有致病性。 [0003]随着畜牧业的发展， 我国牛结核病检测的需求， 特别是对隐性感染以及活动性结 核和非活动性结核的鉴别诊断的需求缺口越来越大。 因此， 加强牛结核病病原检测 技术研 究， 为疫病的控制、 净化， 动物健康， 公共卫 生安全具有重要意 义。 [0004] [0005] [0006]目前对动物 布病的诊断方法有如下的几种： [0007]1)临床诊断 [0008]牛结核病以肺结核最为常见， 其次是乳房结核和肠结核， 以及淋巴结核、 胸膜结核 和腹膜结核， 有时可见肝、 脾、 肾、 生殖器官、 脑、 骨和关节结核， 严重者可表现为全身性 粟粒 性结核。 根据感染累及器官不同， 通常可见呼吸症状、 腹泻、 泌乳减少、 生殖性能紊乱、 神经 症状等。 [0009]肺结核： 病 初易疲劳， 有 短促干咳， 渐变为脓性湿咳， 病情严重者可见呼吸困难， 奶 量大减； 听诊肺区有啰音， 胸膜结核时可听到磨擦 音； 叩诊有实音区并有痛感。 [0010]乳房结核： 一般先是乳房淋巴结肿大， 继而乳腺区发生局限性或弥漫性硬结， 硬结 无热无痛， 表面凹凸不平； 泌乳量减少， 乳汁稀薄， 严重时停止泌乳 。 [0011]肠结核： 多见于犊牛， 迅速消瘦， 以便秘与下痢 交替出现或顽固性下痢为特征， 粪 便混有黏液和脓。 [0012]生殖器官 结核： 性欲亢进， 不断发情但屡配不孕， 流产。 [0013]神经结核： 中枢神经系统受侵害时， 在脑和脑膜等可发生粟粒状或干酪样结核， 常 引起神经症状， 如 癫痫样发作， 运动障碍等。 [0014]2)细菌学诊断 [0015]分枝杆菌的分离培养及鉴定是诊断的 “金标准”。 细菌培养以及涂片镜检等病原学 检查方法， 这是较为常见的一种 方法， 但是结核菌需要8周左右这一较长时间内进行培养。 微生物培养技术是采集病 畜的坏死灶等样本做细菌培养， 观察菌落生长状况并进行鉴别。 但由于分枝 杆菌对营养要求较高， 分离培养操作过程复杂， 培养时间长， 需要专 业技术人员 在生物安全三级以上实验室操作， 分离操作过程存在较高的生物安全风险。 还受动物感染 阶段、 样本中病原体数量及检测前抗生素使用等因素影响， 常导致细菌污染， 不能及时做出 诊断而使病情加重， 具有明显的局限性， 不 适合推广应用。说　明　书 1/11 页 3 CN 114990238 A 3