(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210221474.3 (22)申请日 2022.03.09 (71)申请人 中国动物卫 生与流行病学中心 地址 266032 山东省青岛市 市北区南京路 369号 (72)发明人 孙明军　焉鑫　刘蒙达　田莉莉　 孙世雄　魏润宇　邵卫星　孙淑芳　 孙翔翔　樊晓旭　张浩博　 (74)专利代理 机构 北京识然知识产权代理事务 所(普通合伙) 11975 专利代理师 曾庆国 (51)Int.Cl. C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01)C12R 1/01(2006.01) (54)发明名称 一种可区分牛种和羊种布鲁氏菌的分子标 记和检测方法 (57)摘要 本发明提供了一种可区分牛种和羊种布鲁 氏菌的分子标记和检测方法， 其中可识别所有种 布鲁氏菌的特异性核苷酸片段的序列为SEQ  ID  NO： 1； 用于检测牛种布鲁氏菌的特异性 分子标记 的核苷酸序列为SEQ  ID NO:5； 用于检测羊种布 鲁氏菌的特异性分子标记的核苷酸序列为SEQ   ID NO:9。 本发明还通过用于检测上述特异性核 算片段的引物对和探针。 本发明制备的BSCP引物 和探针具有通用性， 可检测所有种的布鲁氏菌， 引物探针不但可以独立使用， 也可以制备成三重 实时荧光定量PCR方法， 用于布鲁氏菌种的鉴定。 检测的样品可以是分离的菌株， 也可以是临床收 集的流产物、 奶、 拭子、 组织等样品， 而且具有高 敏感性、 高特异性 等特点。 权利要求书1页 说明书12页 序列表3页 附图5页 CN 114790490 A 2022.07.26 CN 114790490 A 1.一种用于鉴别牛种、 羊种、 猪种和犬种布鲁氏菌的特异性核酸片段， 其特征在于， 所 述的特异性核酸片段的序列为SEQ  ID NO： 1。 2.用于检测权利要求1所述的特异性核酸片段的引物对， 其特征在于， 所述的引物对， 其上游引物的序列为SEQ  ID NO： 2， 下游引物的序列为SEQ  ID NO： 3。 3.用于检测权利要求1所述的特异性核酸片段的探针， 其特征在于， 所述的探针的序列 为SEQ ID NO： 4。 4.一种用于检测牛种布鲁氏菌的特异性核酸片段， 其特征在于， 所述的特异性核酸片 段的序列为SEQ  ID NO： 5。 5.用于检测权利要求1所述的特异性核酸片段的引物对和探针， 其特征在于， 所述的引 物对， 其上游引物的序列为SEQ  ID NO： 6， 下游引物的序列为SEQ  ID NO： 7； 所述的探针的序 列为SEQ ID NO： 8。 6.一种用于检测羊种布鲁氏菌的特异性核酸片段， 其特征在于， 所述的特异性核酸片 段的序列为SEQ  ID NO： 9。 7.用于检测权利要求9所述的特异性核酸片段的引物对和探针， 其特征在于， 所述的引 物对， 其上游引物的序列为SEQ  ID NO： 10， 下游引物的序列为SEQ  ID NO： 11； 所述的探针的 序列为SEQ  ID NO： 12。 8.如权利要求3、 权利要求5和权利要求7中所述的探针， 其特征在于， 所述探针采用荧 光报告和淬灭基团进行修饰， 荧光报告基团修饰在探针序列5 ′端,淬灭基团修饰在探针序 列3′端。 9.权利要求2、 权利要求3、 权利要求5和权利要求7中所述的引物对和探针在制备牛种 和羊种布鲁氏菌鉴别诊断试剂盒中的应用。 10.一种牛种和羊种布鲁氏菌鉴别诊断试剂 盒， 其特征在于， 所述的试剂盒中包含有权 利要求2、 权利要求3、 权利要求5和权利要求7中所述的引物对和探针。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114790490 A 2一种可区分牛种和羊种布鲁氏菌的分子标记和检测方 法 技术领域 [0001]本发明属于病原体分子检测技术领域， 具体涉及一种可区分牛种和羊种  布鲁氏 菌的分子标记， 以及检测该分子标记的实时荧 光定量PCR引物、 探针  及检测方法。 背景技术 [0002]布鲁氏菌病(以下简称布病)是一种由布鲁氏菌(Brucella)引起的重  要的人兽共 患传染病,是国际动物 卫生组织(OIE)规定必须通报的动物疫病，  《中华人民共和国传染病 防治法》 规定其为乙类传染病。 该病不仅危害牛、  羊、 猪等各种动物， 造成严重经济损失， 还 会通过发病动物或畜产品将疾病  传染给人， 造成人的发热、 睾丸炎、 流产和关节炎等病症， 严重者甚至丧失 劳动和生育能力， 对我国养殖业、 食品安全与人类健康构成重大威胁。 [0003] [0004]在世界范围内， 布鲁氏菌共有11个种(含23个生物 型)， 最常见的种  有牛种布鲁氏 菌(B.abortus)、 羊种布鲁氏菌(B.melitensi s)、 猪种布  鲁氏菌(B.su is)、 绵羊附睾种布鲁 氏菌(B.ovi s)、 沙林鼠布鲁氏菌(B.  neotomae)和犬种布鲁氏菌(B.canis)。 我国以牛、 羊布 病的发病率最高，  地理分布最为广泛， 其致病因子分别是牛种和羊种布鲁氏菌。 牛种和羊 种布 鲁氏菌也是我国人布病的主要致病因子， 99％的人布病是由它们引起的。 我国  猪和 犬布病呈散发态势， 其致病因子 分别为猪种和犬种布鲁氏菌， 这两种布  鲁氏菌偶尔也可感 染人， 但其对人的危害程度远没有 牛种和羊种布鲁氏菌严  重。 目前， 除了牛、 羊、 猪、 犬这四 种布鲁氏菌外， 其他种的布鲁氏菌在我  国尚未被发现。 由此可见， 在我国， 消除牛、 羊布病 是阻止布病从动物向人  传播的关键 。 [0005]目前， 常规的布鲁氏菌病原学检测手段是病原分离鉴定。 因为要进行细  菌培养， 工作人员有感染的风险， 因此病原分离鉴定必须在生物安全三级实  验室内进 行， 限制了该 方法的推广应用。 另一方面， 细菌培养和鉴定至少需  要两周时间， 既费时又费力， 不能满足 目前疫情处理快速高效的要求。 所以，  准确、 快速的病原学诊断技术是目前布病防控所急 需解决的问题之一。 实时  荧光定量PCR(Quantitative  Real‑time PCR)是目前最广泛使用 的病原学诊  断方法之一， 具有很高的敏感性和特异 性。 与其他的分子检测方法相比(如  数 字PCR、 恒温 或等温PCR等)， 实时荧 光定量PCR技 术更成熟， 稳定性更  高， 更易于推广。 发明内容 [0006]本发明提供了一种可区分牛种和羊种布鲁氏菌 的分子标记和检测方法，  即一种 可区分牛种和羊种布鲁氏菌的分子标记， 以及检测该标记的实时荧光  定量PCR引物、 探针 及检测方法。 [0007]本发明首先提供一种可识别所有种布鲁氏菌(包括牛种、 羊种、 猪种和  犬种)的特 异性核苷酸片段， 其核苷酸序列如下： [0008]CCGGAGCCTATAAGGACGTGGCGGAAACACCGACCCTTGCCGTTGCCGCACAGTGGGTGACG  AGCGC CAAGCAGCCGGACGACCTCATCTATA ACATCACCAAGGTTCTCTGGAACGAGGATACACGC  AA(SEQ ID NO： 1)说　明　书 1/12 页 3 CN 114790490 A 3