ICS 65.020 CCS B 05 22 吉 林 省 地 方 标 准 DB22/T 3289—2021 玉木耳液体菌种生产技术规程 A code of practice for liquid spawn production of white wood ear 2021 - 11 - 26 发布 2021 - 12 - 15 实施 吉林省市场监督管理厅 发 布 DB22/T 3289—2021 前 言 本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本文件由吉林省农业农村厅提出并归口。 本文件起草单位：吉林农业大学、黑龙江黑臻生物科技有限公司。 本文件主要起草人：李晓、张波、徐安然、钱可晴、杨迪、刘宗、Samwel、马世玉。 I DB22/T 3289—2021 玉木耳液体菌种生产技术规程 1 范围 本文件确立了玉木耳液体菌种生产的程序，规定了玉木耳液体菌种生产条件、生产技术、贮存和记 录与档案。描述了生产记录等追溯方法。 本文件适用于玉木耳液体菌种的生产。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 150.4 压力容器 第四部分：制造、检验和验收 GB 4789.28 食品安全国家标准 食品微生物学检验 培养基和试剂的质量要求 GB 5749 生活饮用水卫生标准 GB/T 12728-2006 食用菌术语 GB 50073 洁净厂房设计规范 NY/T 391 绿色食品 产地环境质量 NY/T 528 食用菌菌种生产技术规程 NY/T 1846 食用菌菌种检验规程 DB22/T 2603 玉木耳菌种 3 术语和定义 GB/T 12728 界定的以及下列术语和定义适用于本文件。 3.1 玉木耳 white wood ear 由吉林省农作物品种审定委员会审定的毛木耳（Auricularia cornea）的白色变异新品种（吉菌登 2016002）。 3.2 液体菌种 liquid spawn 培养基为液体状态的菌种。 [来源：GB/T 12728—2006，2.5.30]。 3.3 液体菌种发酵罐 cultivation apparatus for liquid spawn 食用菌液体菌种培养专用设备，要求不锈钢材质，并符合 GB/T 150.4 的要求。 3.4 接种量 inoculation rate 1 DB22/T 3289—2021 接入发酵罐中的食用菌菌种数量，用菌种体积与培养基体积的百分比表示。 3.5 发酵罐空消 empty fermenter cultivation apparatus 对尚未加水投料的空发酵罐进行高压蒸汽灭菌。 3.6 发酵罐实消 full fermenter cultivation apparatus 对投料后的发酵罐进行高压蒸汽灭菌。 4 生产流程 玉木耳液体菌种生产流程见图 1。 图1 液体菌种生产流程图 5 生产要求 5.1 生产条件 5.1.1 人员要求 从事液体菌种生产的各级操作人员应具有食用菌菌种生产或检验人员从业资格证方可上岗。 5.1.2 环境卫生 5.1.2.1 场地地势平坦且干燥、空气优良、通风好，排水顺畅，交通便利，水源电源充足，水质应符 合 GB 5749 要求。 5.1.2.2 附近 3000 m 无废水、废气、废渣、粉尘、烟尘和垃圾场、畜禽场等污染源，环境卫生指标 应符合 NY/T 391 的规定。 5.1.3 生产车间 2 DB22/T 3289—2021 地面防水、防腐蚀、防渗漏、防滑、易清洗，应有 1.0°～1.5°的排水坡度和排水系统，排水沟 应是圆弧式的明沟；墙壁和天花板能防潮、防霉、防水、易清洗。 5.1.4 接种车间 应按照 GB 50073 规定执行。 5.1.5 液体菌种生产车间 5.1.5.1 水、电（停电需配备发电机）、蒸汽、空气循环四大系统配备完善保证生产需求。 5.1.5.2 液体菌种生产车间应按照 GB 50073 规定执行。 5.1.6 生产设施 液体菌种生产车间设置菌种配制室、灭菌室、无菌接种室、恒温培养室、发酵液配料室、发酵罐培 养室、化验室和菌种保藏室，且布局合理，规模配套。其中部分场所应达到如下要求： a) 摇瓶培养室和发酵罐培养室应配备调温设施，空间洁净度达到十万级； b) 无菌接种室洁净度达到万级，接种机位置空气洁净度达到百级； c) 化验室和菌种保藏室有相应实验检测设备和灭菌设施及常规用具。 5.1.7 生产设备 包括发酵罐、液体菌种接种器、高压蒸汽灭菌锅、备用发电设备、调温设备、除湿设备、百级净化 系统、层流罩、超净工作台、恒温摇床、恒温培养箱、冰箱、普通光学显微镜、磁力搅拌器、大量程电 子称、电子天平、pH 计等。 5.1.8 培养原料 所用原料应符合 NY/T 528 的要求，生物制剂和天然材料的水不溶性固体物料应小于 40 目。 5.1.9 生产品种 选用优质、高产、稳定、抗逆性强、商品性好的玉木耳品种，从具备相应资质的单位引种，使用经 省级以上农作物品种审定委员会审（认）定或登记（备案）的品种，并符合 DB22/T 2603 的要求。 5.2 生产技术 5.2.1 母种制备 使用母种固体培养基，配方参见附录 A.1，生产应符合 NY/T 528 的要求。 5.2.2 摇瓶菌种制备 5.2.2.1 培养基配方 配方按照附录 A.2 。 5.2.2.2 培养基制备 选无青皮、未发芽的新鲜马铃薯 200 g，洗净、去皮、去芽眼，切成块状，加水文火煮沸 15 min， 用 4 层湿纱布过滤得滤液，再加入其余原料至溶解，定容至 1000 mL。 3 DB22/T 3289—2021 5.2.2.3 分装 使用 500 mL～1000 mL、耐 121 ℃ 高温的无色玻璃三角瓶，装液量为三角瓶容积的 1/3～3/5， 在三角瓶中放入两粒转子，使用棉塞封瓶口，棉塞外加盖四层纱布，灭菌时棉塞外加盖牛皮纸防潮。 5.2.2.4 高压灭菌 将分装好的三角瓶放入高压蒸汽灭菌锅内进行高压灭菌，121 ℃ 灭菌 30 min。灭菌完毕后自然降 压待温度降至 70 ℃ 以下，打开灭菌锅将装有液体培养基的三角瓶取出放入接种室。 5.2.2.5 冷却接种 三角瓶液体培养基自然冷却至 20 ℃～25 ℃ 时接种。在无菌条件下，使用经火焰灼烧灭菌并冷却 的接种针挑取 8 块 ～10 块（2～3）mm ×（2～3）mm 母种菌块迅速转接于待接种摇瓶培养基内，封 瓶口，接种完成后贴好标签。 5.2.2.6 恒温培养 具体操作与要求如下： a) 培养室消毒：培养室使用前 2 d 采用臭氧发生器消毒，并用 5% 的新洁尔灭溶液或 75% 酒精 擦拭消毒恒温培养箱和恒温振荡摇床； b) 培养条件：将三角瓶放入 25 ℃ 恒温箱中静置培养 1 d，然后置于磁力搅拌器或恒温摇床上 培养，温度控制在 25 ℃ ± 1 ℃，转速 140 rpm～160 rpm，培养时间 7 d～9 d。 5.2.2.7 菌种标准检验 具体操作与要求如下： a) 菌丝形态：静止 10 min 后观察，菌球下沉（占 90% 以上）且呈白色，上清液澄清透明，表面 无或有少量泡沫，菌球颗粒大小均匀一致，菌球表面菌丝呈刺球状； b) 酸碱度：pH 值在 5.0～5.5 之间； c) 镜检：平皿显微镜下观察无杂菌。 5.2.3 发酵罐液体菌种制备 5.2.3.1 发酵罐检查及发酵罐空消 具体操作与要求如下： a) 检查液体菌种发酵罐上全部阀门及压力表，要求无损坏并能正常工作； b) 清洗待用发酵罐内壁、用水冲洗安全阀、压力表、罐盖，确保无杂物、无菌皮； c) 发酵罐初次使用、出现杂菌、长期放置或更换品种等情况出现其一时应进行发酵罐空消，空 消要求蒸汽压力 0.12 MPa、温度为 121 ℃、灭菌 40 min。 5.2.3.2 液体培养基制备 按照附录 A.3 配方称取原料，原料应符合 GB 4789.28 中的规定，用水符合 GB 5749 中的要求。 5.2.3.3 投料定容 4 DB22/T 3289—2021 使用漏斗通过上料口将原料加入罐体，装液量为罐体容量的 60%～70%，加入 0.03% 消泡剂，通入 空气搅拌 1 min～2 min 混合均匀，将液体菌种发酵罐口擦干后盖上罐盖，拧紧螺丝，再次检查发酵罐 各部位安装是否合格。 5.2.3.4 发酵罐实消 打开蒸汽阀门给发酵罐通蒸汽，当温度到达 90 ℃时关闭空气压缩机，继续加热使发酵罐温度达到 121 ℃ 保持 80 min，温度不应低于 121 ℃。 5.2.3.5 冷却和调压 实消结束后关闭蒸汽阀门停止加热，开启冷水阀门开始降温，当温度降至 110 ℃、压力降至接近 0 Mpa 时，打开空气压缩机开关，给发酵罐通入无菌空气，当温度降至 25 ℃ 时关闭冷却水。 5.2.3.6 接种 具体操作步骤与要求如下： a) 接种前，接种人员清洗双手，然后再用 75% 酒精消毒； b) 关闭通风系统，接种结束后再开启； c) 调整发酵罐微量进气，保持正压； d) 用酒精棉擦拭接种口附近，并用酒精喷灯消毒； e) 接种口周围放置酒精棉并点燃，关闭排气阀，打开接种口，拿取摇瓶菌种在火焰上方拔 掉瓶塞，灼烧瓶口 10 s～13 s 后将菌种倒入发酵罐中，接种量为 1:1000； f) 灼烧接种口盖子 8 s～10 s 后盖好接种口； g) 打开排气阀，调整进气量。 5.2.3.7 培养 具体操作与要求如下： a) 罐内换气量 1: 0.4 V/V～1.2 V/V（料液体积/空气体积），即接种完毕 1 d～2 d 微量进气， 3 d 后逐渐加大进气量，5 d～6 d 后大进气量进气，6 d～7 d 进气速度不变； b) 温度始终控制在 25 ℃±2 ℃； c) 罐内压保持在 0.05 MPa。 5.2.4 罐内液体菌种纯度检测 发酵罐液体菌种培养至 48 h～72 h，应对罐内菌种进行一次杂菌检测，具体检测内容及要求见附 录 B。 5.2.5 罐内液体菌种质量检测 8 d 后达到放罐质量标准即可放罐, 发酵罐液体菌种质量标准参见附录 C。终止发酵后，罐内外温 度均保持在 25 ℃ ±2 ℃，应在 4 h 内完成接种。 5.2.6 放罐接种 放罐接种应按下列步骤进行： a) 连接接种管道，通蒸汽消毒 30 min，待管道冷却后连接至菌种罐； 5 DB2