(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210240063.9 (22)申请日 2022.03.10 (71)申请人 公安部物证鉴定中心 地址 100038 北京市西城区木樨地 南里17 号 (72)发明人 孙启凡　石慧霞　季安全　魏孙祥　 胡胜　赵一霞　 (74)专利代理 机构 北京纪凯知识产权代理有限 公司 11245 专利代理师 闫书宁 (51)Int.Cl. C12Q 1/6888(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12Q 1/686(2018.01) (54)发明名称 一种利用数字PCR鉴定精液的方法及其专用 试剂盒 (57)摘要 本发明公开了一种利用数字PCR鉴定精液的 方法及其专用试剂盒。 本发明成功建立了双重数 字PCR检测miR ‑891a‑5p与内参基因RNU6b的体 系， 从而获得了基于数字PCR技术的准确、 灵敏的 精液检验方法， 能够实现精液的100％准确鉴别， 混合斑、 微量精液、 模拟案件精斑样本均被准确 判定。 因此， 本发明具有很好的应用前景， 有望在 法医实际案件中进行广泛应用。 本发 明具有重要 的应用价 值。 权利要求书2页 说明书10页 序列表2页 附图1页 CN 114525349 A 2022.05.24 CN 114525349 A 1.一种用于鉴定精液的试剂盒， 包括引物对89 1、 逆转录引物89 1、 水解探针89 1、 引物对 RNU6b、 逆转录引物RNU6b和水解探针RNU6b； 引物对891由正向引物 ‑891F和反向引物 ‑891R组成； 水解探针891的5 ′末端具有荧 光标记甲， 3 ′末端具有非荧 光淬灭基团； 引物对RNU6b由正向引物RNU6b ‑F和反向引物RNU6b ‑R组成； 水解探针RNU6b的5 ′末端具有荧 光标记乙， 3 ′末端具有非荧 光淬灭基团； 所述逆转录引物891的核苷酸序列如SEQ  ID NO： 2所示； 所述正向引物 ‑891F的核苷酸序列如SEQ  ID NO： 3所示； 所述反向引物 ‑891R的核苷酸序列如SEQ  ID NO： 4所示； 所述水解探针891的核苷酸序列如SEQ  ID NO： 5所示； 所述逆转录引物RNU6b的核苷酸序列如SEQ  ID NO： 7所示； 所述正向引物RNU6b ‑F的核苷酸序列如SEQ  ID NO： 8所示； 所述反向引物RNU6b ‑R的核苷酸序列如SEQ  ID NO： 9所示； 所述水解探针RNU6b的核苷酸序列如SEQ  ID NO： 10所示。 2.根据权利要求1所述的试剂盒， 其特征在于： 所述荧光标记甲为HEX荧光标记； 所述荧 光标记乙为FAM荧 光标记； 所述非荧 光淬灭基团为MGB探针的淬灭基团。 3.权利要求1或2所述的试剂盒的应用， 为如下d1)或d2)： d1)鉴定或辅助鉴定精液； d2)检测或辅助检测待测样本中是否含有精液； 所述应用 用于非疾病的诊断与治疗。 4.一种鉴定或辅助鉴定待测样本中是否含有精液的方法， 包括如下步骤： (a1)获得若干精液样本和若干非精液样本中 的miR‑891a‑5p拷贝浓度和miR ‑891a‑5p/ RNU6b比值； 所述miR ‑891a‑5p/RNU6b比值为miR ‑891a‑5p拷贝浓度和RNU6b拷贝浓度的比 值； 所述非精液样本为月经 血、 外周血、 唾液和阴道分泌液中的至少一种； (a2)对步骤(a1)获得的miR ‑891a‑5p拷贝浓度和miR ‑891a‑5p/RNU6b比值进行ROC曲线 分析， 获得鉴定精液的miR ‑891a‑5p最佳截断值和鉴定精液的miR ‑891a‑5p/RNU6b比值最佳 截断值； 之后进行如下判断： 若待测样本的miR ‑891a‑5p拷贝浓度低于阴性对照样本， 则待测样本不含有精液； 若待测样本的miR ‑891a‑5p拷贝浓度高于阴性对照样本且大于miR ‑891a‑5p最佳截 断 值， 则待测样本含有精液； 若待测样本的miR ‑891a‑5p拷贝浓度高于阴性对照样本且为miR ‑891a‑5p最佳截 断值 以下： 当待测 样本的log2(miR ‑891a‑5p/RNU6b)＞log2(miR ‑891a‑5p/RNU6b比值最佳截断 值)时， 则待测 样本含有精液； 当待测 样本的log2(miR ‑891a‑5p/RNU6b)≤log2(miR ‑891a‑ 5p/RNU6b比值 最佳截断值)时， 则待测样本不含有精液； 所述方法用于非疾病的诊断与治疗。 5.根据权利要求4所述的方法， 其特征在于： 所述miR ‑891a‑5p拷贝浓度和所述RNU6b拷 贝浓度的获得 方法包括如下步骤： (1)取样本的总RNA， 采用逆转录引物891和逆转录引 物RNU6b进行反转录， 获得样本 的权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114525349 A 2cDNA； (2)以步骤(1)获得的样本的cDNA为模板， 以水解探针891、 正向引物 ‑891F、 反向引物 ‑ 891R、 水解探针RNU6b、 正向引物RNU6b ‑F和反向引物RNU6b ‑R进行数字PCR， 获得微滴数据； 根据微滴数据获得miR ‑891a‑5p拷贝浓度和RNU6b拷贝浓度； miR ‑891a‑5p拷贝浓度低于 0.1copies/ μL视为未检出， 拷贝浓度记为0 copies/ μL； 所述逆转录引物891的核苷酸序列如SEQ  ID NO： 2所示； 所述正向引物 ‑891F的核苷酸序列如SEQ  ID NO： 3所示； 所述反向引物 ‑891R的核苷酸序列如SEQ  ID NO： 4所示； 所述水解探针891的核苷酸序列如SEQ  ID NO： 5所示； 水解探针891的5 ′末端具有荧光 标记甲， 3 ′末端具有非荧 光淬灭基团； 所述逆转录引物RNU6b的核苷酸序列如SEQ  ID NO： 7所示； 所述正向引物RNU6b ‑F的核苷酸序列如SEQ  ID NO： 8所示； 所述反向引物RNU6b ‑R的核苷酸序列如SEQ  ID NO： 9所示； 所述水解探针RNU6b的核苷酸序列如SEQ  ID NO： 10所示； 水解探针RNU6b的5 ′末端具有 荧光标记乙， 3 ′末端具有非荧 光淬灭基团。 6.根据权利要求5所述的方法， 其特征在于： 所述荧光标记甲为HEX荧光标记； 所述荧光 标记乙为FAM荧 光标记； 所述非荧 光淬灭基团为MGB探针的淬灭基团。 7.根据权利要求5所述的方法， 其特征在于： 进行数字PCR的体系中， 水解探针891和水 解探针RNU6b的浓度为250nmol/L， 正向引物 ‑891F、 反向引物‑891R、 正向引物RNU6b ‑F和反 向引物RNU6b ‑R的浓度为90 0nmol/L。 8.根据权利要求5所述的方法， 其特征在于： 进行数字PCR的反应程序为95℃10min； 94 ℃30s， 59.8℃6 0s， 72℃3 0s， 45个热循环； 98℃10mi n； 4℃保持。 9.根据权利要求 4所述的方法， 其特 征在于： 所述阴性对照样本的制备 方法如下： (a1)制备反应体系； 反应体系含有dNTP  mix、 RT Buffer、 RNase  Inhibitor、 逆转录引 物891、 逆转录引物RNU6b、 样本的总RNA和去 核酸酶水； 所述逆转录引物891的核苷酸序列如SEQ  ID NO： 2所示； 所述逆转录引物RNU6b的核苷酸序列如SEQ  ID NO： 7所示； (a2)将反应 体系进行反转录， 获得 阴性对照样本 。 10.检测待测样本中miR ‑891a‑5p拷贝浓度和RNU6b拷贝浓度的物质的应用， 为如下d1) 或d2)： d1)鉴定或辅助鉴定精液； d2)检测或辅助检测待测样本中是否含有精液； 所述应用 用于非疾病的诊断与治疗。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114525349 A 3