(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210231702.5 (22)申请日 2022.03.10 (71)申请人 杭州医学院 地址 310000 浙江省杭州市滨江高教园区 (72)发明人 金大智　陈毓　宋小军　 (74)专利代理 机构 杭州求是专利事务所有限公 司 33200 专利代理师 万尾甜　韩介梅 (51)Int.Cl. C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/6844(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/145(2006.01) (54)发明名称 产毒型艰难梭菌快速核酸检测专用引物组、 试剂盒及方法 (57)摘要 本发明属于细菌检测技术领域， 具体涉及一 种产毒型艰难梭菌快速核酸检测专用引物组、 试 剂盒及方法； 引物组包括如SEQ  ID No.1～SEQ   ID No.10的10 条特异性引物， 该方法采用等温核 酸扩增技术MCDA(多重交叉置换扩增技术)实现， 具有低成本、 高稳定性、 高特异性和高灵敏度的 特点， 可快速特异性检测产毒型艰难梭菌， 灵敏 度可达5拷贝/反应 。 权利要求书1页 说明书4页 序列表2页 附图1页 CN 114480692 A 2022.05.13 CN 114480692 A 1.一种产毒型艰难梭菌快速核酸检测专用引物组， 其特 征在于， 包括 tcdB_F1： CTGA AGGATTACCTATAATTGC tcdB_F2： ATCTCGA AGTACAAGTTCATTG tcdB_D1： T TTCACTTAGCTCTTTGATTGC tcdB_D2： G GATTTAGTATACT TTTAGTTCC tcdB_C1： T TTCTTGTCTTAATAATGGGTCACTCG tcdB_C2： A ATCATTACTTCATCTTTGGGGATAGC tcdB_R1： CTGCCATTATACCTATCTTAGC tcdB_R2： A ATTTAACAACAGCTACA ACTGC tcdB_CP1： T TCTTGTCTTAATAATGGGTCACTCGATAGATG GTGTAAGTTTAGGTGC tcdB_CP2： A ATCATTACTTCATCTTTGGGGATAGCGTATAC CTGCTGAAATTCCTGC。 2.一种产毒型艰难梭菌快速核酸检测的试剂 盒， 其特征在于， 包括权利要求1所述的引 物组。 3.根据权利要求2所述的产毒型艰难梭菌快速核酸检测的试剂 盒， 其特征在于， 试剂 盒 中还含有 Warm Start LAMP 2X预混液及50 X LAMP荧光染料,Warm  Start LAMP 2X预混液包 含Bst 2.0Warm Start DNA聚合酶、 Warm  Start RTx反转录酶和LAMP缓冲液。 4.一种产毒型艰难梭菌快速核酸检测方法， 其特 征在于， 具体包括如下步骤： 模板DNA的提取： 提取待检样品的DNA； 配制反应体系： 引物混合液1.2μL， Warm  Start LAMP 2X预混液5μL， LAMP荧光染料 (50X)0.5 μL,模板DNA  1 μL， 用灭菌去离 子水补齐到10 μl； 进行MCDA扩增反应并检测。 5.根据权利要求4所述的产毒型艰难梭菌快速核酸检测方法， 其特征在于， 所述待检样 品是疑是艰难梭菌感染的病人粪便标本或疑是含艰难梭菌 菌株的样品。 6.根据权利要求4所述的产毒型艰难梭菌快速核酸检测方法， 其特征在于， 所述引物混 合液中， tcdB_CP1、 tcdB_CP2浓度分别为2.4pmol/ μL； tcdB_D1、 tcdB_D2、 tcdB_R1、 tcdB_R2 浓度分别为1.2pmol/ μL； tcdB_C1、 tcdB_C2浓度分别为0.8pmol/ μL； tcdB_F1、 tcdB_F2浓度 分别为0.4pmo l/ μL。 7.根据权利要求4所述的产毒型艰难梭菌快速核酸检测方法， 其特征在于， 所述MCDA扩 增的程序为： 6 3℃30分钟， 95℃， 5分钟。 8.根据权利要求4所述的产毒型艰难梭菌快速核酸检测方法， 其特征在于， 采用MCDA扩 增结合SYBR荧 光检测进行 结果判读， 每1分钟检测一次SYBR  GREEN荧光； 阴性结果判定： 如果样本扩增曲线均不呈S型、 Ct值 为UNDET， 则结果 为阴性； 阳性结果判定： 如果样本对应通道扩增曲线呈S型， 则结果 为阳性。 9.根据权利要求4所述的产毒型艰难梭菌快速核酸检测方法， 其特征在于， 在扩增结束 后采用核酸电泳或胶体金显色方法对 扩增结果进行判读。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114480692 A 2产毒型艰难 梭菌快速核酸检测专用引物组、 试剂盒及方 法 技术领域 [0001]本发明属于生物医学领域， 具体而言， 涉及一种鉴定产毒型艰难梭菌的方法， 尤其 涉及一种产毒型艰难梭菌快速核酸检测专用引物组、 试剂盒及方法。 背景技术 [0002]艰难梭菌是目前公认的院内感染和抗生素相关性腹泻的重要病原体之一。 艰难梭 菌感染可引起伪膜性肠炎、 中毒型巨结肠、 肠穿孔、 弥漫性血管内凝血、 肾衰竭和脓毒症等 严重的并发症。 据美国疾控中心的统计数据， 每年大约有50万人感染艰难梭菌， 其中约2.0 万死于该菌感染。 美国疾控中心已将艰难梭菌列为耐药性细菌威胁等级最高的 “紧急”级 别。 因此， 艰 难梭菌感染已成为全世界高度关注的严重院内感染问题之一。 传统的生物学鉴 定方法主要是进行细菌培养、 GDH抗原反应等， 耗时较长， 因此有必要建立一种快速鉴定艰 难梭菌的试剂方法， 对临床艰难梭菌感染的确证及用药具有重要的指导意义。 目前鉴别艰 难梭菌的分子生物方法有ELISA、 免疫胶体金以及荧光PCR法等， 以上各种方法虽然可能在 临床上提供较好的价值， 但因操作繁琐、 灵敏度低、 耗时较长、 还需要其他方法辅助进行鉴 定、 或需要配备昂贵的仪器设备及试剂等 不同的原因未能在临床上 大规模推广使用。 发明内容 [0003]本发明的目的在于针对现有技术的不足， 提供一种产毒型艰难梭菌快速核酸检测 专用引物组、 试剂盒及方法； 该方法采用等温核酸扩增技术MCDA(多重交叉置换扩增技术) 实现， 具有低成本、 高稳定性、 高特异性和高灵敏度的特点， 灵敏度可达 5拷贝/反应。 [0004]为达到上述目的， 本发明所采用的技 术方案如下： [0005]本发明根据艰难梭菌tcdB毒力基因的特异性设计10条特异性引物， 构成用于快速 鉴定产毒性艰难梭菌的特异性引物组， 包括： [0006]tcdB_F1： CTGA AGGATTACCTATAATTGC(SEQ ID No.1) [0007]tcdB_F2： ATCTCGA AGTACAAGTTCATTG(SEQ ID No.2) [0008]tcdB_D1： T TTCACTTAGCTCTTTGATTGC(SEQ ID No.3) [0009]tcdB_D2： G GATTTAGTATACT TTTAGTTCC(SEQ ID No.4) [0010]tcdB_C1： T TTCTTGTCTTAATAATGGGTCACTCG(SEQ  ID No.5) [0011]tcdB_C2： A ATCATTACTTCATCTTTGGGGATAGC(SEQ  ID No.6) [0012]tcdB_R1： CTGCCATTATACCTATCTTAGC(SEQ ID No.7) [0013]tcdB_R2： A ATTTAACAACAGCTACA ACTGC(SEQ  ID No.8) [0014]tcdB_CP1： TTTCTTGTCTTAATAATGGGTCACTCGATAGATGGTGTAAGTTTAGGTGC(SEQ  ID  No.9) [0015]tcdB_CP2： AATCATTACTTCATCTTTGGGGATAGCGTATACCTGCTGAAATTCCTGC(SEQ  ID  No.10) [0016]一种产毒型艰难梭菌快速核酸检测的试剂盒， 包括前述的10条引物； 上述试剂盒说　明　书 1/4 页 3 CN 114480692 A 3