(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210234335.4 (22)申请日 2022.03.10 (71)申请人 浙江农林大 学 地址 311300 浙江省杭州市临安区吴肃街 666号浙江农林大 学 (72)发明人 董彬　赵宏波　叶勇　王艺光　 杨丽媛　肖政　钟诗蔚　方遒　 (74)专利代理 机构 北京成越律师事务所 16 070 专利代理师 蔡艳园 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 梅花实时荧光定量PCR分析中内参基因的筛 选方法和应用 (57)摘要 本发明公开了GAPDH、 UBQ、 Actin7、 PP2A和 Actin1基因作为内参基因及其专用引物在梅花 实时荧光定量PCR分析中的应用； 本发明还公开 了一种梅花实时荧光定量PCR分析中内参基因的 筛选方法， 可为梅花分子水平研究研究提供理论 基础和技 术保障。 权利要求书2页 说明书11页 序列表6页 附图5页 CN 114457187 A 2022.05.10 CN 114457187 A 1.GAPDH、 UBQ、 Actin7、 PP2A和Actin1基因作为内参基因在梅花实时荧光定量PCR分析 中的应用； 在梅花不同品种的叶片间分析时， 采用GAP DH和UBQ基因作为内参基因； 在梅花不同品种的花 瓣间分析时， 采用GAP DH和Acti n1基因作为内参基因； 在‘美人’梅不同组织中分析时， 采用Acti n7和UBQ基因作为内参基因； 在‘美人’梅不同开花时期中分析时， 采用P P2A和Actin1基因作为内参基因。 2.根据权利要求1所述的应用， 其特征在于： 所述GAPDH的核苷酸序列如序列表中SEQ   ID NO.1所示， 所述UBQ的核苷酸序列如序列表中SEQ  ID NO.2所示， 所述Actin7的核苷酸序 列如序列表中SEQ  ID NO.3所示， 所述PP2A的核苷酸序列如序列表中SEQ  ID NO.4所示， 所 述Actin1的核苷酸序列如序列表中SEQ  ID NO.5所示。 3.一种用于扩增权利要求1所述的内参基因的专用引物， 其特征在于： 所述GAPDH基因 的引物序列如序列表中SEQ  ID NO.6和SEQ  ID NO.7所示； 所述UBQ基因的引物序列如序列 表中SEQ ID NO.8和SEQ  ID NO.9所示； 所述Actin7基因的引物序列如序列表中SEQ  ID  NO.10和SEQ  ID NO.11所示； 所述PP2A基因的引物序列如序列表中SEQ  ID NO.12和SEQ  ID  NO.13所示； 所述Acti n1基因的引物序列如序列表中SEQ  ID NO.14和SEQ  ID NO.15所示。 4.权利要求3所述的专用引物在梅 花实时荧 光定量PCR分析中的应用。 5.一种梅花实时荧光定量PCR分析中内参基因的筛选方法， 其特征在于： 包括如下步 骤： (1)材料准备： 选取生长一致、 无病虫害的梅花品种 ‘长艳宫粉 ’、‘北京玉蝶 ’、‘美人’ 梅、‘骨红朱砂 ’、‘淡丰后’、‘江梅垂枝 ’的叶片； 选取 ‘美人’梅一年生枝条、 多年生枝条、 幼 叶、 成熟叶、 盛花期的花瓣， 同时采集 ‘美人’梅花发育四个不同时期的样品， 包括小蕾期、 大 蕾期、 初开期、 盛开期， 每组样品3个生物学重复， 所有样 品收集后液氮速冻， 放置于－80℃ 冰箱保存备用； (2)总RNA提取和cDNA的合成； (3)候选内参基因 的选择和引物设计， 其中， 候选内参基因为从梅花基因组数据库中筛 选出的EF1α、 GAPDH、 Actin1、 Actin2、 Actin3、 Actin7、 UBQ、 PP2A、 TUA、 TUB1、 TUB2、 TUB3、 TUB4、 PHK共14个候选内参基因序列； (4)qRT‑PCR分析； (5)实验数据处 理与分析； (6)内参基因验证： 在梅花不同品种的叶片和花瓣中， 选择原血红素IX法尼基转移酶基 因COX10和花青素还原酶基因AN R作为目的基因， 在 ‘美人’梅不同组织和开花时期分别选用 纤维素合 成酶基因CESE1和扩展蛋白A20基因Expansin ‑A20作为目的基因， 选择稳定性好的 两个内参基因和稳定性最差的一个基因， 观察 目的基因的表达模式， 对内参表达稳定性的 排序结果的可靠性进行验证； 如稳定性好的内参基因与目的基因表达模式一致， 稳定性差 的基因与目的基因表达模式不 一致， 则说明 内参表达稳定性的排序结果可靠 。 6.根据权利要求5所述的梅花实时荧光定量PCR分析中内参基因 的筛选方法， 其特征在 于： 步骤(4)中， 反应体系如下： cDNA模板1.0 μL， 上下游引物各0.4 μL， TB  GREEN Premix Ex  Taq(Tli RNaseH Plus)(2×)5 μL， ddH2O 3.2 μL， 共10 μL； 实时荧光PCR反应程序如下： 95℃ 下预变性3min， 95℃变性5s， 60℃退火30s， 共45个循环； 每个 反应重复3次； 引物扩增效率由权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114457187 A 2cDNA浓度梯度稀释10倍后反应产生的标准曲线决定， 扩增效率E＝(10－1/s‑1)×100％， 其中 s为曲线斜 率。 7.根据权利要求6所述的梅花实时荧光定量PCR分析中内参基因 的筛选方法， 其特征在 于： 步骤(5)中， 候选内参基因稳定性采用geNorm、 NormFinder、 BestKeeper和ΔCt  4个程序 软件对14个候选内参基因的表达水平进行测定， 最后结合在线程序 RefFinder结果综合筛 选出最佳内参基因。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114457187 A 3