(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210242350.3 (22)申请日 2022.03.11 (71)申请人 中国疾病预防控制中心传染病预防 控制所 地址 102206 北京市昌平区昌百路15 5号 (72)发明人 田国忠　 (74)专利代理 机构 济南圣达知识产权代理有限 公司 372 21 专利代理师 李筝 (51)Int.Cl. C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/01(2006.01) (54)发明名称 一种用于鉴别人苍白杆菌的引物、 探针组合 及检测试剂盒 (57)摘要 本发明涉及一种用于鉴别人苍白杆菌的引 物、 探针组合及检测试剂盒。 本发明采用三个基 因、 双荧光基团标记的一步法荧光定量PCR检测 技术， 可以检测与鉴定纯菌及血液等标本中苍白 杆菌属和人苍白杆菌种菌株核 酸DNA， 灵敏度高， 可检测到3.67fg的核酸DNA(Ct值为35.38)， 即 PCR反应体系只要有1个核酸DNA拷贝数即能检 出。 采用三个基因同时检测， 极大的提高血液等 标本中苍白杆菌属和人苍白杆菌核酸DNA的检出 率。 本试剂盒操作 简单， 不需要凝胶电泳， 标本细 菌基因组DNA提取后， 1个小时即可报告检测与鉴 定结果， 尤其适合血液等微量核酸DNA的检测与 鉴定。 权利要求书2页 说明书8页 序列表2页 附图2页 CN 115058524 A 2022.09.16 CN 115058524 A 1.以下任意 位点在鉴别人苍白杆菌方面的应用， 所述 位点包括： (1)Ochrobactrum  anthropi  ATCC 49188chromosome  1反链DNA的1540097 ‑1540122位 点和180232 0‑1802345位点， 以及Ochrobactrum  anthropi ATCC 49188 chromosome 2正链 DNA的1602609‑1602634位点； (2)Ochrobactrum anthropi  ATCC 49188 chromosome  1反链DNA的57 737‑57788位点； (3)Ochrobactrum  anthropi  ATCC 49188 chromosome  1正链DNA的607436 ‑607484位 点和反链DNA的843602 ‑843630位点， 以及Ochrobactrum  anthropi  ATCC 49188  chromosome  2正链DNA的10843 51‑1084379位 点。 2.如权利要求1所述位点在鉴别人苍白杆菌方面的应用， 其特征在于， 所述检测方法包 括但不限于基于PCR方法、 免疫印迹、 酶联免疫、 生物测序； 进一步的， 采用PCR扩增方式， 结合上述三个位点共同进行鉴别， 所述引物为上述三个 位点的引物组合。 3.如权利要求1所述位点在鉴别人苍白杆菌方面的应用， 其特征在于， 所述述 Ochrobactrum anthropi  ATCC 49188 chromosome  1的序列号 为GenBan k:CP000758.1； 所述Ochrobactrum  anthropi  ATCC 49188 chromosome  2序列号为GenBank: CP000759.1。 4.一种用于鉴别人苍白杆菌的引物和探针组合， 其特征在于， 所述探针及引物序列如 下： 正向引物16s ‑up： 5’ ‑GTCCAGCCGAACTGAAAGACAC‑3’； 反向引物16s ‑down： 5’ ‑CGTAAACGATGAATGTTAGCCGTT‑3’； 探针16s‑probe： 5’ ‑ATCTCTGTGTC CGCGACCGGTATGTC‑3’； 正向引物O sp‑up： 5’ ‑TCTTCCTTCTTGTCCTCGCCC‑3’； 反向引物O sp‑down： 5’ ‑CGGCTCAATTTTCCTCTTTCATC‑3’； 探针Osp‑probe： 5’ ‑ACAGACGA ACACCAAAGATCTCGA ACGCCAAA‑3’； 正向引物Hyp ‑up： 5’ ‑GCGAGCAGCACGCAGCT TC‑3’； 反向引物Hyp ‑down： 5’ ‑GTCGCATTTATTCGGCCTCATAC‑3’； 探针Hyp‑probe： 5’ ‑ACGCCATCTCAAAAGCACTTGGCGATATC ‑3’。 5.如权利要求4所述用于鉴别人苍白杆菌的引物和探针组合， 其特征在于， 所述引物及 探针组合 适用于荧 光PCR检测方法， 所述探针具有荧 光基团及淬灭基团修饰； 优选的， 所述探针16s ‑probe的5 ’端标记荧光基 团FAM， 3’端标记淬灭基 团BHQ‑1； 所述 探针Osp‑probe和探针Hyp ‑probe的5 ’端荧光基团Cy5标记， 3 ’端淬灭基团BHQ ‑2标记。 6.权利要求 4或5所述引物和探针组合在制备鉴别人苍白杆菌产品中的应用。 7.如权利要求6所述引物和探针组合在制备鉴别人苍白杆菌产品中的应用， 其特征在 于， 所述鉴别人苍白杆菌的产品为包括但不限于检测试剂盒、 检测平台、 检测系统或检测器 械中的一种； 优选的， 所述检测试剂盒优选为 一种基于荧 光PCR方法进行检测的试剂盒。 8.一种用于鉴别人苍白杆菌的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒中包括用于检测人苍 白杆菌的引物和探针组合， 所述引物和探针组合的序列如SEQ  ID NO.1‑9所示。 9.如权利要求8所述用于鉴别人苍白杆菌的试剂 盒， 其特征在于， 所述试剂 盒中还包括权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115058524 A 2标本中细菌核酸DNA的提取试剂； 所述标本为纯菌、 血清、 血浆、 全血、 分泌物、 棉拭子、 脓液、 体液、 组织、 器官、 石蜡切片中的一种或几种等； 进一步的， 所述标本为血清、 血浆或全血标 本。 10.如权利要求8所述用于鉴别人苍白杆菌的试剂盒， 其特征在于， 所述检测试剂盒的 使用方式如下， 以标本中提取的细菌核酸DNA为模板， 利用SEQ  IDNO:1‑9所示引物和探针通 过荧光定量PCR反应进行PCR扩增； 进一步的， 所述荧光定量PCR反应的条件为： 90～96℃预变性2～4min； 90 ‑96℃变性4～ 6sec， 55～65℃ 退火15～25sec， 35～45个循环， 最后35～45℃延伸25～35sec； 退火时采集 荧光信号； 所述荧光定量PCR反应体系包括： 荧光定量PCR酶复合物10 μL， 正向引物16s ‑up、 Osp‑up 和Hyp‑up溶液各0.3ul； 反向引物16s ‑dpwn、 Osp ‑down和Hyp ‑down溶液各0.3ul； 探针16s ‑ probe、 Osp ‑probe和Hyp ‑probe溶液各0.4ul， 模板为提取的核酸DNA  2 μL， 补充双蒸馏水至 20 μL体积； 优选地， 正向引物、 反向引物和探针溶 液的浓度为10 μM； 可选地， 荧 光定量PCR酶复合物为2 ×Premix Ex TaqTM。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115058524 A 3