(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210238291.2 (22)申请日 2022.03.11 (71)申请人 郑州大学 地址 450001 河南省郑州市高新 技术开发 区科学大道100号 (72)发明人 刘卫　史进进　张开翔　刘军杰　 张振中　褚梦雨　 (74)专利代理 机构 郑州天阳专利事务所(普通 合伙) 41113 专利代理师 李松莲 (51)Int.Cl. C12Q 1/6818(2018.01) C12N 15/115(2010.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种核酸适配体识别的肿瘤外泌体检测方 法 (57)摘要 一种核酸适配体识别的肿瘤外泌体检测方 法， 利用发夹状探针H1、 荧光 分子FAM修饰的第一 信号探针H2和TAMRA修饰的第二信号探针H3， 肿 瘤外泌体与发夹状探针H1的核酸适配体部分结 合， 打开发夹状探针H1， 释放杂交链式反应所需 的触发序列I， 引发第一信号探针H2和第二信号 探针H3发生杂交链式反应形成长的双链， 第一信 号探针H2的荧光 分子FAM和第二信号探针H3上的 荧光分子TAMRA在形成的双链上彼此靠近， 并发 生荧光共振能量转移， 通过荧光分子 FAM和TAMRA 荧光信号比值即可对肿瘤外泌体进行定量检测。 检测特异性好， 提高在复杂样品中的适用性。 且 灵敏度较高， 避免目前大多数外泌体检测所需要 的繁琐分离过程及其可能引起的误差， 有显著的 社会和经济效益。 权利要求书3页 说明书6页 序列表1页 附图2页 CN 114634973 A 2022.06.17 CN 114634973 A 1.一种核酸适配体识别的肿瘤外泌体检测方法， 其特征在于， 利用识别肿瘤外泌体的 发夹状探针H1、 荧光分子FAM修饰的第一信号探针H2和TAMRA修饰的第二信号探针H3， 当存 在肿瘤外泌体时， 肿瘤外泌体与发夹状探针H1的核酸适配体部 分结合， 打开 发夹状探针H1， 释放杂交链式反应所需的触发序列I， 引发第一信号探针H2和第二信号探针H3发生杂交链 式反应形成长的双链， 第一信号探针H2的荧光分子FAM和第二信号探针H3上的荧光分子 TAMRA在形成的双链上彼此靠近， 并发生荧光共振 能量转移， 伴随着荧光分子TAMRA荧光信 号的增加， 而荧光分子FAM荧光信号降低， 两者的荧光差异与体系中的肿瘤外泌体的浓度正 相关， 通过荧 光分子FAM和TAMRA荧 光信号比值即可对肿瘤外泌体进行定量检测。 2.根据权利要求1所述的核酸适配体识别的肿瘤外泌体检测方法， 其特征在于， 所述发 夹状探针H1是由核酸适配体序列apt和杂交链式反应的触发序列I通过延长序列形成发夹 结构， 触发序列I由于 分子内的核酸杂交处于锁定状态； 发夹状探针H1中的核酸适配体序列 apt与肿瘤外泌体结合后， 释放杂交链式反应所需的触发序列I。 3.根据权利要求1所述的核酸适配体识别的肿瘤外泌体检测方法， 其特征在于， 所述第 一信号探针H2和第二信号探针H3序列存在部 分互补， 在第一信号探针H2的3 ’端和第二信号 探针H3的环部分别修饰能发生 荧光共振能量转移的荧 光分子FAM和TAMRA。 4.根据权利要求1所述的核酸适配体识别的肿瘤外泌体检测方法， 其特征在于， 包括以 下步骤： （1） 、 识别探针的制备： 将含有核酸适配体序列apt与触发序列I的探针溶解于含有250   nM葡萄糖、 5  mM MgCl2·6H2O的PBS缓冲溶液中， 探针浓度为400  nM， 将该溶液至于涡旋混合 仪上30 s混匀， 然后置于水浴中， 逐渐升温至90℃， 10  min后取出， 缓慢冷却至室温， 利用核 酸的互补杂交反应， 得发夹状探针H1， 即识别探针； （2） 、 信号探针的制备： 用含有250  nM葡萄糖、 5  mM MgCl2·6H2O的PBS缓冲溶液分别溶 解荧光分子FAM修饰的第一信号探针H2和荧光分子TAMRA修饰的第二信号探针H3， 第一信号 探针H2和第二信号探针H3的浓度均为800  nM， 涡旋混合仪上30  s混匀， 然后置于水浴中， 逐 渐升高温度至90℃， 10  min后取出， 缓慢冷却至室温， 然后分别与相同量的第一信号探针H2 和第二信号探针H 3混合， 涡旋混合仪上3 0 s混匀， 即得信号探针； （3） 、 肿瘤外泌体检测： 在细胞溶液中加入上述步骤制备的识别探针和信号探针， 其中， 识别探针的浓度和信号探针的浓度比为1:4， 反应3h， 当没有肿 瘤外泌体存在时， 识别探针 中的触发序列I不能触发信号探针的杂交链式反应， 此时荧光分子FAM和TAMRA距离较远， 检 测不到FAM和TAMRA之间的FRET信号， 当存在肿瘤外泌体时， 利用荧光分光光度计检测反应 液在480 nm激发光激发下， 荧光分子FAM和TAMRA的荧光发射强度， 实现对肿瘤外泌体进行 定量检测。 5.根据权利要求1 ‑4任一项所述的核酸适配体识别的肿瘤外泌体检测方法， 其特征在 于， 所述的肿瘤外泌体为肺癌A549细胞。 6.根据权利要求5所述的核酸适配体识别的肿瘤外泌体检测方法， 其特征在于， 包括以 下步骤： （1） 、 肺癌A549细 胞培养及外泌体提取： 用含有质量浓度10%的无外泌体胎牛血清FBS的 RPMI 1640培养基作为细胞培养液， 培养液中补加质量浓度1%的青霉素或链霉素， 将肺癌 A549细胞在含有体积浓度5%的二氧化碳恒温箱中培养， 温度为37℃， 当细胞生长至80 ‑90%权　利　要　求　书 1/3 页 2 CN 114634973 A 2时， 收集细胞上清液； 将收集的细胞上清液用离心超滤法分离纯化其中的细胞外泌体， 具体 为： 在2500  g的离心条件 下， 对收集的细胞上清液进行离心30  min， 然后将上清用0.22  m的 超滤膜进行过滤， 除去其中的细胞碎片， 接着在5000  g的条件下， 用100  kDa的超滤管对收 集液进行离心处理30min， 将收集的含外泌体的溶液溶解在pH  7.4的 PBS中， 储存于 ‑80℃ 条件下备用； （2） 、 识别探针的制备： 将含有核酸适配体序列apt与触发序列I的探针溶解于含有250   nM葡萄糖、 5  mM MgCl2·6H2O的PBS缓冲溶液中， 探针浓度为400  nM， 将该溶液至于涡旋混合 仪上30 s混匀， 然后置于水浴中， 逐渐升温至90℃， 10  min后取出， 缓慢冷却至室温， 利用核 酸的互补杂交反应， 得发夹状探针H1， 即识别探针； （3） 、 信号探针的制备： 用含有250  nM葡萄糖、 5  mM MgCl2·6H2O的PBS缓冲溶液分别溶 解荧光分子FAM修饰的第一信号探针H2和荧光分子TAMRA修饰的第二信号探针H3， 第一信号 探针H2和第二信号探针H3的浓度均为800  nM， 涡旋混合仪上30  s混匀， 然后置于水浴中， 逐 渐升高温度至90℃， 10  min后取出， 缓慢冷却至室温， 然后分别与相同量的第一信号探针H2 和第二信号探针H 3混合， 涡旋混合仪上3 0 s混匀， 即得信号探针； （4） 、 绘制标准曲线： 在不同浓度的肺癌A549细胞来源的外泌体中分别加入制备的识别 探针和信号探针， 其中， 识别探针的浓度和信号探针的浓度分别为50nM和200nM， 反应3h， 利 用荧光分光光度计检测反应液在480  nm激发光激发下， FAM在522  nm和TAMRA在580nm处的 荧光发射 强度， 以外泌体浓度为横坐标， 以522  nm和580 nM处的荧光 强度比值为 纵坐标， 绘 制标准曲线， 其中R2为0.992； 得出， 随着肺癌A549细胞的浓度越大， 荧 光强度比值越大， （5） 、 选择性响应考 察： 培养收集正常的细胞培养液上清， 采用与步骤 （1） 同样的方法分别收集提取其外泌体， 以得到的不同细胞来源的外泌体作为对照， 使各个待测溶液中包含的外泌体的总量相当， 在相同条件下， 加入相同浓度的检测探针， 通过荧光仪器记录各个样品在荧光分子FAM和 TAMRA发射波长处的荧光强度值， 并以两者的比值作为体系荧光共振能量转移 程度的信号， 得出， 对照细胞来源的外泌体所产生的荧光共振能量转移信号均较弱， 远低于相同浓度肺 癌A549细胞来源的外泌体产生的信号 强度； 表明能特异识别检测肺癌A549细胞来源的外泌 体， 而对其它不同细胞来源的外泌体不响应， 检测肺癌A549细胞外泌体的高选择性； （6） 、 复杂生物样品中外泌体的检测： 以Bst细胞外泌体为干扰物， 分别在PBS和10%的 FBS中检测体系的荧光共振能量信号， 得出， 含Bst细胞来源的外泌体组与不含干扰外泌体 的组的荧光信号无明显差异， 在10%FBS中结果与PBS中结果均为出现干扰， 表明对目标肿瘤 细胞外泌体的检测没有干扰。 7.根据权利要求1 ‑6任一所述的核酸适配体识别的肿瘤外泌体检测方法， 其特征在于， 所述核酸 适配体序列apt的序列为： 5 ’ ‑TTT ATG GGT GGG TGG GGG GTT TTT‑3’； 触发序列I的序列为： 5  ’ ‑  CACCCATAAAGACTGATGT TGA  ‑3’； 发夹状探针H1的序列为： 5 ’ ‑ CAC CCA TAA AGA CTG ATG TTG ATC AGT CTT TAT G