(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210243378.9 (22)申请日 2022.03.11 (71)申请人 中国科学院化学研究所 地址 100190 北京市海淀区中关村北一 街2 号 (72)发明人 方晓红　张振　刘维凤　徐丽　 (74)专利代理 机构 北京辰权知识产权代理有限 公司 11619 专利代理师 侯君然 (51)Int.Cl. C12Q 1/682(2018.01) C12Q 1/04(2006.01) G01N 21/64(2006.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种无分离体系中细胞外囊泡及其亚型的 检测方法和应用 (57)摘要 本发明涉及一种无分离体系中细胞外囊泡 及其亚型的检测方法和应用， 本发 明提供一种检 测探针， 其包括探针 Ⅰ、 探针Ⅱ和探针Ⅲ； 所述探 针Ⅰ的一端标记有生物素， 另一端标记有第一识 别单元； 所述探针 Ⅱ的一端标记有荧光染料； 所 述探针Ⅲ的一端标记有第二识别单元； 所述探针 Ⅰ与所述探针 Ⅱ部分配对， 使得所述生物素与所 述荧光染料相互靠近； 所述探针 Ⅰ、 所述探针 Ⅱ分 别与所述探针 Ⅲ部分配对， 使得所述探针 Ⅰ、 探针 Ⅱ和探针Ⅲ在检测靶 标存在的条件 下， 通过联合 立足作用， 杂交形成T型结构。 本发明还提供了相 应的检测方法， 可以在无分离体系中实现对细胞 外囊泡的检测， 具有操作简单、 检测迅速、 灵敏度 高、 不易受荧光强度波动、 荧光漂白的影响等优 点。 权利要求书2页 说明书11页 序列表3页 附图3页 CN 114807314 A 2022.07.29 CN 114807314 A 1.一种检测探针， 其特征在于， 包括探针 Ⅰ、 探针Ⅱ和探针Ⅲ； 所述探针 Ⅰ的一端标记有 生物素， 另一端标记有第一识别单元； 所述探针 Ⅱ的一端标记有荧光染料； 所述探针 Ⅲ的一 端标记有第二识别单 元； 所述探针 Ⅰ与所述探针 Ⅱ部分配对， 使得所述生物素与所述荧光染料相互靠近； 在检测 靶标存在的条件下， 所述探针 Ⅰ、 所述探针 Ⅱ分别与所述探针 Ⅲ部分配对， 使得所述探针 Ⅰ、 探针Ⅱ和探针Ⅲ杂交形成T型 结构； 所述第一识别单元特异性识别细胞膜、 第一靶标蛋白、 第 一靶标多糖或第 一靶标脂类； 所述第二识别单 元特异性识别细胞膜、 第二靶标蛋白、 第二靶标多糖或第二靶标脂类。 2.如权利要求1所述的检测探针， 其特征在于， 所述第一识别单元为胆固醇、 第一核酸 适体或第一 抗体； 优选地， 所述第二识别单 元为胆固醇、 第二核酸 适体或第二 抗体。 3.如权利要求1所述的检测探针， 其特征在于， 所述探针 Ⅰ中， 标记有第 一识别单元的一 端具有第一 非配对序列， 所述第一非配对序列无法与所述检测探针中的其他序列进行互补 配对； 优选地， 所述探针 Ⅲ中， 标记有第 二识别单元的一端具有第 二非配对序列， 所述第二非 配对序列无法与所述检测探针中的其 他序列进行互补配对； 优选地， 所述第一非配对序列和所述第二非配对序列的长度各自独立 地选自0‑80bp； 优选地， 所述第 一非配对序列和所述第 二非配对序列 各自独立地选自寡聚胸腺嘧啶核 苷酸、 寡聚腺嘌呤核苷酸、 寡聚胞嘧啶核苷酸、 寡聚鸟嘌呤核苷酸、 寡聚尿嘧啶核苷酸。 4.如权利要求1所述的检测探针， 其特征在于， 所述探针 Ⅰ与所述探针 Ⅱ的部分配对的 序列长度、 探针 Ⅰ与探针Ⅲ的部分配对的序列长度、 探针 Ⅱ与探针Ⅲ的部分配对的序列长度 各自独立 地选自5‑30bp。 5.一种检测体系， 其特 征在于， 包括权利要求1 ‑4任一项所述的检测探针和缓冲液。 6.如权利要求5所述的检测体系， 其特 征在于， 所述检测体系还 包括链霉亲和素； 优选地， 所述缓冲液包括PBS缓冲液， Mg2+； 优选地， 所述检测体系中， 所述检测探针的浓度为0.5 ‑5nM； 优选地， 所述检测体系中， 所述探针 Ⅰ、 探针Ⅱ、 探针Ⅲ的摩尔比为1 ‑1.2:1‑1.2:1‑1.2； 优选地， 所述检测体系中， 链霉亲和素的浓度为2 ‑20 μg/mL。 7.一种试剂 盒， 其特征在于， 包括权利要求1 ‑4任一项所述的检测探针和/或权利要求5 或6所述的检测体系。 8.权利要求1 ‑4任一项所述检测探针、 权利要求5或6所述检测体系或权利要求7所述试 剂盒在以下(a)、 (b)、 (c)方面的用途： (a)检测总细胞外囊泡； (b)通过靶向一种靶标蛋白检测细胞外囊泡 亚型； (c)通过同时靶向两种靶标蛋白检测细胞外囊泡的亚型； 优选地， 被 检测的细胞外囊泡 来自细胞培 养基、 尿液、 血浆或组织液样本 。 9.一种检测总细胞外囊泡的方法， 其特征在于， 包括提供权利要求1 ‑4任一项所述的检 测探针， 使 所述检测探针与待测样本进 行孵育， 测定荧光各向异 性变化值和/或荧光偏振变 化值；权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114807314 A 2其中， 所述探针 Ⅰ与探针Ⅲ均标记有胆固醇； 优选地， 所述孵 育步骤与测定步骤之间还 包括以下步骤： 加入链霉亲和素进行反应； 优选地， 所述孵 育的时间为20 ‑90min； 所述孵 育的温度为20 ‑37℃； 优选地， 加入链霉亲和素进行反应的时间为5 ‑30min。 10.一种检测细胞外囊泡亚型的方法， 其特征在于， 包括提供权利要求1 ‑4任一项所述 的检测探针， 使所述检测探针与待测样本进 行孵育， 测定荧光各向异 性变化值和/或荧光偏 振变化值； 其中， 所述探针 Ⅰ和探针Ⅲ中的一个标记有胆固醇， 另一个标记有核酸适体或抗体； 所 述核酸适体或抗体特异性结合所述 亚型的一种靶标蛋白； 或者， 所述探针 Ⅰ标记有第一核酸适体或第一抗体， 所述探针 Ⅲ标记有第二核酸适体或第二 抗体； 所述第一核酸适体/第一抗体和所述第二核酸适体/第二抗体分别特异 性结合所述亚 型的两种靶标蛋白； 优选地， 所述孵 育步骤与测定步骤之间还 包括以下步骤： 加入链霉亲和素进行反应； 优选地， 所述孵 育的时间为20 ‑90min； 所述孵 育的温度为20 ‑37℃； 优选地， 加入链霉亲和素进行反应的时间为5 ‑30min。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114807314 A 3