(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210243251.7 (22)申请日 2022.03.11 (71)申请人 山东舜丰生物科技有限公司 地址 250300 山东省济南市长清区芙蓉 路 创新谷孵化器主楼1 1层 (72)发明人 刘艳艳　王雪莹　 (74)专利代理 机构 北京君慧知识产权代理事务 所(普通合伙) 11716 专利代理师 刘晓佳 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/6848(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种用于检测非洲猪瘟病毒的PCR引物和探 针组合物 (57)摘要 本发明提供了一种用于检测非洲猪瘟病毒 的PCR引物和探针组合物。 可以快速高效地检测 非洲猪瘟病毒， 毒株类型鉴定， 特异性高、 灵敏度 高且成本 较低， 检测周期短， 有良好的应用前 景。 权利要求书1页 说明书13页 序列表4页 附图8页 CN 114774581 A 2022.07.22 CN 114774581 A 1.一种用于检测非洲猪瘟病毒的PCR引物和探针组合物， 所述引物和探针组合物包括 第一组合物， 所述的第一组合物包括针对非洲猪瘟病毒P72基因的两对引物和一条探针， 所 述两对引物包括两条外侧引物和两条内侧引物； 所述两条外侧引物包括第一外侧引物和 第 二外侧引物； 所述两条内侧引物包括第一内侧引物和第二内侧引物； 所述探针为第一探针； 所述第一外侧引物序列如SEQ  ID No.1所示； 所述第二外侧引物序列如SEQ  ID No.2所示； 所述第一内侧引物序列如SEQ  ID No.3所示； 所述第二内侧引物序列如SEQ  ID No.4所示； 所述第一探针序列如SEQ  ID No.5所示。 2.根据权利 要求1所述的PCR引物和探针组合物， 其特征在于， 所述PCR引物和探针组合 物还包括第二组合物和/或第三组合物； 所述第二组合物包括针对非洲猪瘟病毒MGF基因的两对引物和一条探针， 所述两对引 物包括两条外侧引物和两条内侧引物， 所述两条外侧引物包括第三外侧引物和 第四外侧引 物； 所述两条内侧引物包括第三内侧引物和 第四内侧引物； 所述探针为第二探针； 所述第三 外侧引物序列如SEQ  ID No.6所示； 所述第四外侧引物序列如SEQ  ID No.7所示； 所述第三 内侧引物序列如SEQ  ID No.8所示； 所述第四内侧引物序列如SEQ  ID No.9所示； 所述第二 探针序列如SEQ  ID No.10所示。 所述第三组合物包括针对非洲 猪瘟病毒CD2V基因的两对引物和一条探针， 所述两对引 物包括两条外侧引物和两条内侧引物， 所述两条外侧引物包括第五外侧引物和 第六外侧引 物； 所述两条内侧引物包括第五 内侧引物和六内侧引物； 所述探针为第三探针； 所述第五外 侧引物序列如SEQ  ID No.11所示； 所述第六外侧引物序列如SEQ  ID No.12所示； 所述第五 内侧引物序列如SEQ  ID No.13所示； 所述第六内侧引物序列如SEQ  ID No.14所示； 所述第 三探针序列如SEQ  ID No.15所示。 3.根据权利要求1或2所述的PCR引物和探针组合物， 其特征在于， 所述第一探针、 所述 第二探针、 所述第三探针彼此之间采用不同的荧 光标记修饰。 4.根据权利要求1至3任一所述的PCR引物和探针组合物， 其特征在于， 所述PCR引物和 探针组合物还包括内标引物和内标探针； 优选地， 所述内标引物的序列如SEQ  ID No.16和 SEQ ID No.17所示， 所述内标探针的序列如SEQ  ID No.18所示。 5.一种检测非洲猪瘟病毒的方法， 所述方法包括利用权利要求1 ‑4任一所述的PCR引物 和探针组合物对待测样品进行检测的步骤。 6.根据权利要求5所述的方法， 其特征在于， 所述PCR引物和探针组合物在同一个扩增 体系下进行PCR扩增 和检测。 7.根据权利要求6所述的方法， 其特征在于， PCR扩增程序包括第一轮扩增程序和第二 轮扩增程序； 所述第一轮扩增程序为95℃预变性5min， 95℃变性5s， 65℃退火延伸35s， 10个 循环； 所述第二轮扩增程序为95℃变性5s， 58℃退火延伸3 5s， 40个循环。 8.根据权利要求5 ‑7任一所述的方法， 其特征在于， 所述待测样品来源于猪的血清、 唾 液、 淋巴结、 脾脏或者肺脏 。 9.一种用于检测或诊断待测动物是否感染非洲猪瘟的试剂盒， 所述试剂盒包括权利要 求1‑4任一所述的PCR引物和探针组合物。 10.权利要求1 ‑4任一所述的PCR引物和探针组合物在检测非洲猪瘟中的用途， 或者在 制备用于诊断或检测非洲猪瘟的试剂或试剂盒中的用途。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114774581 A 2一种用于 检测非洲猪瘟病毒 的PCR引物和探针组合物 技术领域 [0001]本发明涉及分子诊断技术领域， 具体为一种用于检测非洲猪瘟病毒的PCR引物和 探针组合物。 背景技术 [0002]非洲猪瘟(african  swine fever)， 是由非洲猪瘟病毒(african  swine fever  virus)感染家猪和各种野猪(如非洲野猪、 欧洲野猪等)而引起的一种急性、 出血性、 烈性传 染病。 世界动物卫生组织(OIE)将其列为法定报告动物疫病， 该病也是我国重点防范的一类 动物疫情。 其特征是发病过程短， 最急性和急性 感染死亡率高达100％， 临床表现为 发热(达 40～42℃)， 心跳加快， 呼吸困难， 部分咳嗽， 眼、 鼻有浆液性或粘液性脓性分泌物， 皮肤发 绀， 淋巴结、 肾、 胃肠 粘膜明显出血， 非洲猪瘟临床症状与猪瘟症状相似， 只能依靠实验室监 测确诊。 [0003]P72是ASFV病毒的保守结构蛋白， 决定着非洲猪瘟病毒的种系进化常被用于作为 ASFV的鉴定基因， 也是目前公认的诊断常用区域。 [0004]CD2V蛋白是病毒吸附红细胞活性所必须的重要蛋白， 从功能上来说属于宿主免疫 调控相关蛋白， CD2V蛋白由ASFV  EP402R基因编码， 相关研究表明， 与野生病毒株相比， 缺失 EP402R的重组毒虽然不能降低猪群死亡率， 但可以推迟病毒的扩散时间(Borca  MV， Carrillo  C， Zsak L， et al.Deln in domestic  swine.J Virol.1998Apr； 72(4):28819.)。 MGF是ASFV病毒编码中另一个具有免疫抑制特性的蛋白成分， 有关etion  of a CD2 like  gene， 8DR， from  African swine fever virus affects viral infectioASFV的第一个减 毒候选疫苗就是通过敲减MGF实现的(O'Donnell  V,Holinka  LG,Gladue  DP， et  al.African  Swine Fever Virus Georgia Isolate Harboring  Deletions  of MGF360  and MGF505Genes  Is Attenuated  in Swine and Confers Protection  against  Challenge  with Virulent  Parental  Virus.J Virol.2015Jun； 89(11):604856.)。 目前对 于ASFV的减毒候选株研究大多集中于CD2V与M GF两个区域。 目前， 对于非洲猪瘟感染情况的 检测， 不仅需要确诊传染源， 还需要精准确定毒株 类型。 [0005]非洲猪瘟的实验室诊断方法有： 红细胞吸附试验， 直接免疫荧光试验， 间接免疫荧 光试验， 酶联免疫吸附试验， 免疫电泳试验， 间接酶联免疫蚀斑试验、 普通PCR诊断， SYBRGreen实时荧光定量PCR技术， 普通PCR成本较低， 操作方便， 得到了广泛应用， 但普通 PCR诊断存在灵敏度与特异性低的缺点， 且ASFV会存在一定的潜伏期， 普通PCR灵敏度较差， 易造成漏检。 TaqMan探针法实时荧光定量P CR技术以及 包括多重实时荧光PCR技术等在一定 程度上大大提高了灵敏度和特异 性， 但对于病毒载量低的临床样本， 其 实还不足够灵敏， 容 易造成假阴性诊断。 传 统的巢式PCR是一种变异的聚合酶链反应， 使用两对PCR引物扩增目 的片段。 经过两次PCR扩增， 可以极大程度的提高普通PCR的灵敏度， 且二次PCR引物发生非 特异性结合的概率极低， 但是该方法为两步法， 能对病毒检测足够灵敏， 但是有繁琐步骤， 而且开盖容易造成PCR产物交叉污染等缺点， 不适用于临床实验室开展对非洲猪瘟病毒的说　明　书 1/13 页 3 CN 114774581 A 3