(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210237395.1 (22)申请日 2022.03.11 (71)申请人 中国计量大 学 地址 310018 浙江省杭州市江干区下沙高 教园区学源街258号 申请人 杭州市农业 技术推广中心 (72)发明人 李士玉　夏文强　赵丽　张雅芬　 汤近天　崔海峰　叶子弘　俞晓平　 (74)专利代理 机构 杭州天勤知识产权代理有限 公司 33224 专利代理师 沈金龙 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种菰黑粉菌分型鉴定方法及其应用 (57)摘要 本发明公开了一种菰黑粉菌分型鉴定方法 及其应用， 属于分子生物技术领域。 本发明提供 了一种用于菰黑粉菌分型鉴定的靶 标， 所述靶 标 来源于T型菰黑粉菌， 核苷酸序列如SEQ  ID No.1 所示。 本发明提供的一种菰黑粉菌分型鉴定方 法， 可定量检测复杂样品中T型菰黑粉菌， 检测限 低至0.0088ng/μL(22.36copies/μL)， 同时实 现了对植物 不同时期以及不同组织中T型菰黑粉 菌的定量检测。 权利要求书1页 说明书9页 序列表2页 附图7页 CN 114703313 A 2022.07.05 CN 114703313 A 1.一种用于菰黑粉菌分型鉴定的靶标， 其特征在于， 所述靶标来源于T型菰黑粉菌， 核 苷酸序列如SEQ  ID No.1所示。 2.如权利要求1所述靶标在菰黑粉菌分型鉴定中的应用。 3.一种用于菰黑粉菌分型鉴定的引物对， 其特征在于， 所述引物对包括正向引物和反 向引物， 正向引物的核苷酸序列如SEQ  ID No.2所示， 反向引物的核苷酸序列如SEQ  ID  No.3所示。 4.一种用于菰黑粉菌分型鉴定的探针， 其特征在于， 所述探针的核苷酸序列如SEQ  ID  No.4所示。 5.一种用于菰黑粉菌分型鉴定的试剂 盒， 其特征在于， 包括如权利要求3所述的引物对 和权利要求 4所述的探针。 6.一种菰黑粉菌分型鉴定方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： (1)提取含有菰黑粉菌的待检测样品的DNA作为扩增模板； (2)使用荧光定量PCR或数字PCR方法进行检测， 检测使用的引物对包括正向引物和反 向引物， 正向引物的核苷酸序列如SEQ  ID No.2所示， 反向引物的核苷酸序列如SEQ  ID  No.3所示； 检测使用的探针的核苷酸序列如SEQ  ID No.4所示； (3)若能够扩增得到信号， 说明待检测样品中含有 T型菰黑粉菌 。 7.如权利要求6所述的菰黑粉菌分型鉴定方法， 其特征在于， 荧光定量PCR反应体系为： II Probe qPCR SuperMix  10 μL， 正向引物、 反向引物和探针各4pmol， 模板1 μL， 用无菌无核酸 酶水补足至20 μL； 扩增反应条件为95℃预变性2min； 95℃变性15s， 65℃退 火15s， 72℃延伸3 0s， 共40个 循环。 8.如权利要求6所述的菰黑粉菌分型鉴定方法， 其特征在于， 数字PCR反应体系为： ddPCR Supermix  for Probes 10 μL， 正向引物和反向引物各18pmol， 探针5pmol， 模板1μL， 无菌无核酸酶水补至20 μL； 扩增反应条件为95℃预变性10min； 94℃变性30s， 60℃退火&延 伸90s， 共40个 循环； 60℃后延伸10mi n， 反应结束后保持4℃。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114703313 A 2一种菰黑粉菌分型鉴定方 法及其应用 技术领域 [0001]本发明涉及分子生物技 术领域， 尤其涉及一种菰黑粉菌分型鉴定方法及其应用。 背景技术 [0002]菰黑粉菌(Ustilago  esculenta)， 属黑粉菌目(Ustilaginales)黑粉菌科 (Ustilaginaceae)黑粉菌属(Ustilago(Pers.)Roussel)， 与大麦坚黑穗病菌(Ustilago   Hordei)、 玉米黑粉菌(Ustilago  maydis)等具有较近的亲缘关系。 菰黑粉菌是专性寄生于 茭白植株的活体营养型真菌， 其完整生活史包括单倍体融合、 寄主侵染、 菌丝增殖、 冬孢子 形成、 冬孢子萌发、 单倍体腐生等过程。 此菌的菌丝体为多年生， 存在于菰(Zizania   caduciflora)的地下茎内， 夏秋季形成茭白。 除了作为蔬菜， 茭白也可药用， 具有利尿止渴、 清热解毒之功效。 [0003]菰黑粉菌侵染是茭白植物膨大形成可食用肉质茎的关键， 未受菰黑粉菌侵染的植 株茎部不发生膨大。 菰黑粉菌的侵染导致植株薄壁细胞分裂加快， 同时维管束变得过度简 化， 生长锥膨大伸长， 从而形成肥大的肉质茎。 正常茭白与灰茭中的菰黑粉菌具有较大差 异， 正常茭白中菰黑粉菌主要以菌丝体的形态存在， 被称作MT 型菰黑粉菌； 灰茭中菰黑粉菌 主要以灰褐色冬孢子的形式存在， 被称作T型菰黑粉菌(Investigation  on the  differentiation  of two Ustilago  esculenta  strains ‑implications  of a  relationship  with the host phenotypes  appearing  in the fields.BMC  Microbiol, 2017,17(1):228.)。 T型菰黑粉菌侵染茭白植物后， 在膨大茎部累积的大量灰褐色冬孢子严 重影响茭白品质， 进 而影响销售， 造成一定经济损失。 [0004]传统的菰黑粉菌分型鉴定主要根据植物的表型进行判断， 然而出现可用于判别的 植物表型的时间往往是栽培后期， 此时已无法挽回经济损失。 公开号为CN109680090A的专 利申请公开了一种鉴定茭白表型特征 的分子标记及其应用 、 获取方法， 其通过高分辨熔解 曲线的方法进行分析， 可以在茭白苗期对茭白进行表型鉴定分析， 但此方法仅适合菰黑粉 菌定性分析， 不适合定量分析。 最新研究表明单个植物内可能同时含有T型与MT型菰黑粉 菌， 无论是基于植物表型还是高分辨溶解 曲线的方法， 都无法对两种菰黑粉菌进行定量分 析。 [0005]现有技术中亟需一种简便， 灵敏度高， 特异性强， 检测结果可靠的菰黑粉菌分型检 测方法。 探针法荧光定量P CR具有检测速度快、 操作便捷、 结果准确等优点， 可以基于特征序 列对T型和MT型菰黑粉菌进行鉴定及定量。 发明内容 [0006]为解决现有技 术中的不足， 本发明提供了一种菰黑粉菌分型鉴定方法及其应用。 [0007]本发明提供了一种用于菰黑粉菌分型鉴定的靶标， 所述靶标来源于T型菰黑粉菌， 核苷酸序列如SEQ  ID No.1所示。 [0008]本发明有提供了所述靶标在菰黑粉菌分型鉴定中的应用。说　明　书 1/9 页 3 CN 114703313 A 3