(19)国家知识产权局 (12)发明 专利 (10)授权公告 号 (45)授权公告日 (21)申请 号 202210236562.0 (22)申请日 2022.03.11 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 114317605 A (43)申请公布日 2022.04.12 (73)专利权人 暨南大学 地址 510630 广东省广州市黄埔大道西6 01 号 (72)发明人 杨英　韩建邦　赵铮　何妞　丁燕　 李晨　 (74)专利代理 机构 广州艾维专利商标代理事务 所(普通合伙) 44739 专利代理师 黄强 (51)Int.Cl. C12N 15/85(2006.01)C12N 15/90(2006.01) C12N 15/65(2006.01) C12N 15/12(2006.01) C12N 15/113(2010.01) A01K 67/027(2006.01) C12Q 1/6888(2018.01) C12N 15/11(2006.01) 审查员 张娟 (54)发明名称 一种小胶质细胞钾离子探针转基因小鼠模 型的构建方法 (57)摘要 本发明涉及一种小胶质细胞钾离子探针转 基因小鼠的构建方法。 本发明通过构建小胶质细 胞钾离子探针转基因小鼠模型， 通过小胶质细胞 特有的Cx3cr1基因的启动子驱动在小胶质细胞 内表达钾离子绿色荧光探针GINKO1， 其能与胞内 钾离子结合表现出绿色荧光信号， 最终反应钾离 子浓度的变化， 从而实现在活体小鼠大脑实时观 察小胶质细胞和巨噬细胞内观察钾离子的动态 变化。 本发 明对小胶质细胞和巨噬细胞相关疾病 的研究有极大的意义， 比如阿尔茨海默症、 帕金 森和中风等神经退行性疾病。 除此之外， 还对小 胶质细胞和巨噬细胞的生物学研究有巨大的推 动作用， 为后续相关疾病模型的建立及临床研究 工作奠定 了坚实的理论研究基础。 权利要求书1页 说明书5页 序列表11页 附图2页 CN 114317605 B 2022.06.21 CN 114317605 B 1.一种小胶质细胞钾离子探针转基因小鼠模型的构建方法， 其特征在于， 包括如下步 骤： （1） 于体外设计并构建针对Cx3cr1基因的特异性gRNA序列， 所述gRNA序列如SEQ  ID  NO： 1所示； （2） 构建Cx3cr1定点基 因敲入GINKO1 ‑P2A‑tdTomato ‑T2A的同源重 组载体， 所述同源重 组载体序列如SEQ  ID NO： 16所示， 通过测序验证载体序列的正确性； （3） 将Cas9蛋白、 gRNA及同源重组载体共同注射至野生型小鼠受精卵中； （4） 取注射后存活的受精卵移植到假孕雌鼠体内， 待其怀孕产仔， 获得 F0代小鼠； （5） 对F0代小鼠提取基因 组DNA， 进行鉴定确认基因型； （6） 待F0代小鼠性成熟后， 与野生型小鼠进行交配， 繁 育获得F1代小鼠； （7） 对F1代小鼠提取基因 组DNA， 进行鉴定确认基因型， 获得相应转基因小鼠模型。 2.根据权利要求1所述的构建方法， 其特征在于， 步骤 （5） 中所述鉴定采用PCR鉴定方 法， 其中所采用的5 ’臂的引物序列为F1和R1， 所述F1 的序列如SEQ  ID NO： 3所示， 所述R1 的 序列如SEQ  ID NO： 4所示； 采用的3 ’臂的引物序列为F2和R2， 所述F2的序列如SEQ  ID NO： 5 所示， 所述R2的序列如SEQ  ID NO： 6所示； 采用的WT引物序列为F3和R3， 所述F3的序列如SEQ   ID NO： 7所示， 所述R3的序列如SEQ  ID NO： 8所示。 3.根据权利 要求1所述的构 建方法， 其特征在于， 步骤 （3） 及步骤 （6） 中所述野生型小鼠 为C57BL/6JGpt小鼠。 4.根据权利要求1所述的构建方法， 其特征在于， 步骤 （7） 中所述鉴定采用PCR鉴定方 法， 其中所采用的5 ’臂的引物序列为F1和R1， 所述F1 的序列如SEQ  ID NO： 3所示， 所述R1 的 序列如SEQ  ID NO： 4所示； 采用的3 ’臂的引物序列为F2和R2， 所述F2的序列如SEQ  ID NO： 5 所示， 所述R2的序列如SEQ  ID NO： 6所示； 采用的WT引物序列为F3和R3， 所述F3的序列如SEQ   ID NO： 7所示， 所述R3的序列如SEQ  ID NO： 8所示。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114317605 B 2一种小胶质细胞钾离 子探针转基因小鼠模型的构建 方法 技术领域 [0001]本发明属于生物医学技术领域， 涉及一种小胶质细胞钾离子探针转基因小鼠模型 的构建方法及其应用。 背景技术 [0002]小胶质细胞作为神经系统的常驻免疫细胞， 在健康和疾病中扮演着异常重要的作 用。 实时动态监测大脑小胶质细胞活动一直是脑科学领域的技术难题。 小胶质细胞在行使 其活动时， 胞内的钾离子起着信使的作用， 因此研究小胶质细胞 的活动变化可以通过观察 其胞内的钾离子变化。 而现有的研究当中， 尚未出现有关小胶质细胞 的相关动物或细胞模 型， 使得与之相关的疾病研究出现了较大的障碍， 不能直观地 通过疾病模型直接进行研究。 发明内容 [0003]本发明的目的在于解决现有技术中所存在的问题， 从而构建一种小胶质细胞钾离 子探针转基因小鼠， 以实现活体观察小胶质细胞的钾离子活动变化。 本发明通过采用成熟 的第三代基因编辑技术CRISPR/Cas9系统， 提供了构建这种小胶质细胞钾 离子探针转基因 小鼠所需要的特殊策略， 以及相应特异的gRNA和Do nor Vector。 [0004]为了解决上述 技术问题， 本发明是通过如下技 术方案得以实现的。 [0005]本发明第一方面提供了一种小胶质细胞钾离子探针转基因小鼠模型的构建方法， 包括如下步骤： [0006]（1） 于体外设计并构建针对Cx3 cr1基因的特异性gRNA序列； [0007]（2） 构建Cx3cr1定点基因敲入GINKO1 ‑P2A‑tdTomato ‑T2A的同源重组载体 （Donor   vector） ， 通过测序验证载体序列的正确性； [0008]（3） 将Cas9蛋白、 gRNA及同源重组载体共同注射至野生型背景小鼠受精卵中； [0009]（4） 取注射后存活的受精卵移植到假孕雌鼠体内， 待其怀孕产仔， 获得 F0代小鼠； [0010]（5） 对F0代小鼠提取基因 组DNA， 进行鉴定确认基因型； [0011]（6） 待F0代小鼠性成熟后， 与野生型背景小鼠进行交配， 繁 育获得F1代小鼠； [0012]（7） 对F1代小鼠提取基因 组DNA， 进行鉴定确认基因型， 获得相应转基因小鼠模型。 [0013]作为优选地 ， 步骤（1）中所述gRNA序列选自SEQ  ID NO ： 1（5 ’‑3’:  TAGATCCAGTTCAGGGAAGG， PAM:  AGG） 、 SEQ  ID NO： 2 （5’ ‑3’: CTCTAGATCCAGTTCAGGGA， PAM:   AGG） 中的一种或多种。 [0014]作为优选地， 步骤 （2） 中所述GINKO1 ‑P2A‑tdTomato‑T2A的同源重组载体的敲入步 骤具体为： 通过同源重组 的方式将所述GINKO1 ‑P2A‑tdTomato ‑T2A基因元件在Cx3cr1基因 转录本的翻译 起始位点插入  GINKO1‑P2A‑tdTomato‑T2A 元件得到GINKO1 ‑P2A‑tdTomato‑ T2A‑Cx3cr1表达框， 进而获得所述Cx3cr1定点基因敲入GINKO1 ‑P2A‑tdTomato ‑T2A的同源 重组载体。 [0015]作为优选地， 步骤 （5） 中所述鉴定采用PCR鉴定方法， 其中所采用的5 ’臂的引物序说　明　书 1/5 页 3 CN 114317605 B 3