(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210245217.3 (22)申请日 2022.03.14 (71)申请人 中国科学院成都生物研究所 地址 610041 四川省成 都市人民南路四段 九号 (72)发明人 唐卓　杜凤　何密鼓　董娟　黄鑫　 丁盛　 (51)Int.Cl. C12Q 1/686(2018.01) C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/6888(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 一种非改性探针及其在实时荧光PCR方法中 的应用 (57)摘要 本发明涉及一种非改性探针和用其进行实 时荧光PCR检测的方法。 本发明首次利用有机小 分子硫磺素T 来进行序列特异性的PCR检测， 实现 不开盖的实时荧光监测。 本发明提供的非改性探 针不需要任何额外的荧光标记， 容易合成， 合成 成本比Taqman探针的成本低得多， 在常温甚至高 温下都很稳定。 本发明提供的实时荧光PCR方法 检测与扩增同时进行， 灵敏准确， 适用于实际样 本的检测分析； 全程都在封闭管中进行， 不需要 开盖添加试剂， 能避免实验室污染。 权利要求书1页 说明书5页 附图1页 CN 114574562 A 2022.06.03 CN 114574562 A 1.一种用于实时荧光PCR的非改性探针， 其特征是： 包含a、 b、 c三部分， a是与目标核酸 模板杂交的序列， 位于探针的中间部分； b是与G ‑四链体完全或部分互补的序列， 位于探针 的其中一端； c为G ‑四链体序列， 位于探针的另一端； 在退火温度及退火温度以下时， 非改性 探针b部分和c部分能通过碱基互补作用对G ‑四链体序列进行全部或部分封闭， 使c部分不 形成G‑四链体二级结构。 2.根据权利要求1中所述的非改性探针， 其特征是： 当存在待测核酸时， G ‑四链体序列 被释放， 能够与小分子化合物结合产生信号； 反之， 探针中的G ‑四链体保持被封闭状态， 不 与小分子化 合物结合产生信号。 3.根据权利要求1、 2中所述的小分子化 合物， 其特 征是： 硫磺素T或硫磺素T衍 生物。 4.根据权利 要求1、 2中所述的所述G ‑四链体序列， 其特征是： 富含G碱基的、 能够与硫磺 素T或硫磺素T衍 生物结合产生 荧光信号的序列。 5.一种利用非改性探针的实时荧光PCR方法， 其特征是： 探针与待测核酸结合的区域位 于正、 反向引物结合域之间； 在PCR体系中加入正 向引物和反向引物、 权利要求1～2所述的 非改性探针、 硫磺素T或硫磺素T衍生物、 核酸聚合酶及其他常规PCR反应组分； PCR时， 高温 变性阶段， 待测核酸双链解开， 非改性探针中的b部分和c部分也将打开， 退火和延伸阶段， 引物和探针都结合到待测核酸链上， 由于P CR体系中所用的核酸聚合 酶具有5’ ‑3’外切酶活 性， 核酸聚合酶能将结合在引物下游的非改性探针剪切， 释放G ‑四链体序列， 释放的G ‑四链 体与PCR体系中 已加入的硫磺素T或硫磺素T衍生物结合能产生荧光， 随着PCR循环数的增 加， 释放的G ‑四链体呈指数倍增加， 实时荧光PCR仪能监测 到荧光值的变化， 呈典型的荧光 扩增曲线； 没有待测核酸存在的情况下， 由于P CR反应不会发生， G ‑四链体序列不能释放， 从 而实时荧 光PCR仪上不能监测到荧 光值的变化。 6.根据权利要求5中所述的核酸聚合酶， 其特征是： 具有5 ’ ‑3’外切酶活性的耐热性核 酸聚合酶。 7.根据权利 要求5所述的利用非改性探针的实时荧光PCR方法， 其特征在于： PCR的反应 程序为92 ‑98℃预变性0 ‑5min； 92‑98℃， 0‑30s； 45‑65℃， 0‑30s， FAM通道或SYBR  Green通道 收集荧光信号； 72℃， 0 ‑30s； 共25‑45个循环。 8.根据权利要求5所述的利用非改性探针的实时荧光PCR方法， 其特征是： 通过是否产 生显著高于阴性对照背景信号的荧 光扩增曲线判断是否检测到目标核酸。 9.根据权利要求5中所述的利用非改性探针的实时荧光PCR方法， 其特征是： 通过标准 曲线可以对待测目标核酸进行定量。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114574562 A 2一种非改性探针及其在实时荧光PCR方 法中的应用 技术领域 [0001]本发明属于分子生物学领域， 涉及核酸分析检测， 具体涉及一种 非改性探针及其 在实时荧 光PCR方法中的应用。 背景技术 [0002]实时荧光PCR是基因检测中最常用的方法， 一般包括两种： 染料法和探针法。 染料 法是在PCR反应体系中， 加入过量荧光染料(如SYB R Green I)， 荧光染料特异性地掺入DNA 双链后， 在特定波长能发射出强烈荧光信号， 而不掺入链中的SYBR染料分子荧光信号保持 不变， 从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。 探针法最常用的是TaqMan探 针， TaqMan探针是一条两端分别标记有荧光分子和荧光淬灭分子的DNA分子， 它的序列和 PCR扩增区间的序列互补， 在PCR反应进行过程中能够与扩增出的一条单链DNA杂交形成双 链。 由于Taq  DNA聚合酶具有的5 ’ ‑3’的外切酶活性， 当它沿引物从5 ’ ‑3’进行延伸遭遇探针 时， 就会将探针序列进 行剪切。 这样荧光分子和荧光淬灭分子在空间分离， 荧光分子的荧光 不再被淬灭。 随着反应的进行， 越来越多的探针被剪切， 整个反应体系的荧光就逐渐增加。 TaqMan探针检测方法是在P CR反应中扩增出目的的基因片断后才能发生相应的探针剪切而 产生荧光， 所以特异性的荧光探针是酶链聚合检测中最为快捷准确的方法。 现有的基于 Taqman探针的传统实时荧光PCR虽然 特异性、 灵敏度、 重复性都非常好， 能够检测1个拷贝的 目标分子， 但是存在以下不足： [0003]第一， 检测时间长， 通常需要1 ‑2小时， 如果该方法用于临床诊断时直接导致病人 筛查效率低， 对传染病疫情防控将造成很大的压力； [0004]第二， 检测试剂盒的价格高昂， 由于该类探针是经过化学修饰的核酸探针， 合成成 本不菲， 因此基于Taqman探针的检测试剂盒大多价格昂贵， 致使相应的病原检测成本居高 不下； [0005]第三， Taqman探针合成的时间较长， 普通DNA合成一般只需一天， 由于探针需要化 学修饰后进行高效液相色谱纯化， 合成的总时间需要一个星期； [0006]第四， 与普通DNA相比， Taqman探针荧 光基团稳定性较差， 需避光低温保存。 [0007]因此， 开发一种 非改性的特异性探针和利用其实现实时荧光PCR检测具有很重要 的现实意 义。 [0008]G‑四链体富含鸟嘌呤， 是近年来研究较多的一种结构。 有的G ‑四链体能与氯高铁 血红素(hemin)结合， 具有类似于过氧化物酶的活性； 有的G ‑四链体能与原卟啉， 锌卟啉等 小分子结合， 产生荧光或颜色的变化。 但是上述小分子化合物耐热性较差， 且与G ‑四链体的 结合不具有热稳定性， 在PCR加热时， 小分子化合物会分解或结合物会分离。 因此以往的报 道都需要在P CR结束后， 开盖加入小分子产生荧光 或颜色信号的变化。 这种终点检测的方法 不能实时监测PCR的过程， 而且开盖可能产生PCR产物的污染， 影响检测的准确性。 硫磺素T 是一种稳定的小分子， 它能够与特定序列的G ‑四链体结合， 并且产生显著的荧光， 目前有 大 量研究报道了硫磺素T及其衍生物与不同序列的G ‑四链体结合能够产生荧光， 并且已经应说　明　书 1/5 页 3 CN 114574562 A 3