(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210244238.3 (22)申请日 2022.03.14 (71)申请人 天津市农业科 学院 地址 300192 天津市南 开区航天道 26号 (72)发明人 王利丽　李秀丽　江珊　鄢明华　 路超　张莉　任卫科　董志民　 田向学　朱琪　李富强　 (74)专利代理 机构 北京高沃 律师事务所 1 1569 专利代理师 苏士莹 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 同时检测猪德尔塔冠状病毒、 呼肠孤病毒和 猪嵴病毒的核酸组合物、 试剂盒及检测方法 (57)摘要 同时检测猪德尔塔冠状病毒、 呼肠孤病毒和 猪嵴病毒的核酸组合物、 试剂盒及检测方法。 本 发明属于猪病原 检测技术领域， 具体涉及同时检 测猪德尔塔冠状病毒、 呼肠 孤病毒和猪嵴病毒的 核酸组合物、 试剂盒及检测方法。 本发明提供的 所述核酸组合物能够特异性识别猪德尔塔冠状 病毒、 呼肠孤病毒和猪嵴病毒， 利用所述核酸组 合物建立的三重荧光定量PCR检测方法， 具有快 速、 方便、 高效、 灵敏度高的特点， 可广泛应用于 猪腹泻病流行病学调查、 实验室鉴别检测和相关 科学研究， 具体 很高的实际应用价 值。 权利要求书1页 说明书12页 序列表2页 附图5页 CN 114438265 A 2022.05.06 CN 114438265 A 1.一种同时检测猪德尔塔冠状病毒、 呼肠孤病毒和猪嵴病毒的核酸组合物， 其特征在 于， 包括针对猪德尔塔冠状病毒的正向引物PDCoV ‑F、 反向引物PDCoV ‑R和探针PDCoV ‑P， 针 对呼肠孤病毒的正向引物PKV ‑F、 反向引物PKV ‑R和探针PKV ‑P以及针对猪嵴病毒的正向引 物MRV‑R、 反向引物MRV ‑R和探针MRV ‑P； 所述针对猪德尔塔冠状病毒的正向引物序列如SEQ  ID NO.1所示； 所述针对猪德尔塔冠状病毒的反向引物序列如SEQ  ID NO.2所示； 所述针对猪德尔塔冠状病毒的探针序列如SEQ  ID NO.3所示； 所述针对呼肠孤病毒的正向引物序列如SEQ  ID NO.4所示； 所述针对呼肠孤病毒的反向引物序列如SEQ  ID NO.5所示； 所述针对呼肠孤病毒的探针序列如SEQ  ID NO.6所示； 所述针对猪嵴病毒的正向引物序列如SEQ  ID NO.7所示； 所述针对猪嵴病毒的反向引物序列如SEQ  ID NO.8所示； 所述针对猪嵴病毒的探针序列如SEQ  ID NO.9所示。 2.根据权利要求1所述的核酸组合物， 其特征在于， 所述针对猪德尔塔冠状病 毒的探针 序列、 针对呼肠孤病毒的探针序列以及针对猪嵴病毒的探针序列的5 ’端均采用荧光报告基 团修饰， 3 ’端均采用荧 光淬灭基团修饰。 3.根据权利要求2所述的核酸组合物， 其特征在于， 所述针对猪德尔塔冠状病 毒的探针 序列的5’端、 针对呼肠 孤病毒的探针序列的5 ’端以及针对猪嵴病毒的探针序列的5 ’端分别 采用不同荧 光波长的报告基团修饰。 4.一种同时检测猪德尔塔冠状病 毒、 呼肠孤病 毒和猪嵴病 毒的试剂 盒， 其特征在于， 包 括权利要求1～3任一所述的核酸组合物。 5.权利要求1～3任一所述的核酸组合物或权利要求4所述的试剂 盒在制备同时检测猪 德尔塔冠状病毒、 呼肠孤病毒和猪嵴病毒的产品中的应用。 6.一种同时检测猪德尔塔冠状病 毒、 呼肠孤病 毒和猪嵴病 毒的方法， 其特征在于， 包括 以下步骤： 提取检测样本的总RNA， 反转录得cDNA； 以所述cDNA模板， 利用权利 要求1～3任一项所述的核酸组合物进行荧光PCR反应， 并收 集荧光信号及Ct值， 当Ct值大于 36时判定为阴性。 7.根据权利要求6所述的方法， 其特征在于， 所述荧光PCR反应的反应体系以25μL计包 括： 12.5 μL  2×Premix Ex Taq， 10 μmol/L  PDCoV‑F、 PDCoV‑R、 PKV‑F、 PKV‑R、 MRV‑F和MRV‑R 各0.5 μL～1.4 μL， 10 μmol/L  PDCoV‑P、 PKV‑P和MRV‑PcDNA各0.3 μL～0.8 μL， 4 μL  cDNA和余量 的水。 8.根据权利 要求7所述的方法， 其特征在于， 所述荧光PCR反应的的程序为： 第一阶段95 ℃预变性3min； 第二阶段94℃变性10s， 55.8℃延伸30s， 共40个循环， 在延伸阶段收集荧光 信号。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114438265 A 2同时检测猪 德尔塔冠状病毒 、 呼肠孤病毒和猪嵴病毒 的核酸 组合物、 试剂盒及检测方 法 技术领域 [0001]本发明属于猪病原检测技术领域， 具体涉及同时检测猪德尔塔冠状病毒、 呼肠孤 病毒和猪嵴病毒的核酸组合物、 试剂盒及检测方法。 背景技术 [0002]近年来， 猪腹泻病的流行越来越广， 且疾病的复杂程度日益增加， 给我国畜牧业造 成了严重的经济损失。 猪流行性腹泻病毒(Porcineepidemic  diarrhea virus， PEDV)、 猪传 染性胃肠炎病毒(Transmissiblegastroenteritis  virus， TGEV)和猪轮状病毒(Porcine   rotavirus， PoRV)是引起猪腹泻的三种重要的病毒性病原。 近年来不断报道有新的腹泻病 原出现， 导 致猪腹泻病原复杂化， 鉴别检测困难。 [0003]猪德尔塔冠状病毒(Porcine  delta coronavirus， PDCoV)又称猪丁型冠状病毒， 属冠状病毒 科德尔塔冠状病毒属， 是一种有囊膜的单股 正链RNA病毒。 该病毒 可感染不同日 龄的猪， 感染率约为20％～30％， 主要引起呕吐、 腹泻、 脱 水等临床症状。 哺乳仔猪对其易 感 性较强， 临床症状更加严重， 感染后病死率高达 50％～100％。 [0004]哺乳动物呼肠 孤病毒(Mammalian  orthoreovirus， MRV)是广泛传播并感染几乎所 有哺乳动物， 且通常具有低致病性。 包括人类、 水貂、 猪、 牛、 蝙蝠和狗等， 具有人畜共患性。 2005年曾智勇等(曾智勇,郭万柱,徐志文,宋振辉,殷华平,王新,王小玉.仔猪腹泻粪样中 猪呼肠孤病毒的分离鉴定,畜牧兽医学报2007,38(6):574～580)从疑似 “冬痢”的仔猪腹湾 粪样中检出呼肠孤病毒， 预示猪呼肠孤病毒 可能与该类疾病有关， 对猪具有一定的致病性。 因此， 快速检测该病原能为该病的早期防控提供 科学依据。 [0005]猪嵴病毒(Porcine  kobuvirus， PKV)是小RNA病毒科嵴病毒属成员， 该病毒主要危 害3周龄以下的仔猪， 可引起仔猪胃肠炎， 出现严重腹泻， 甚至死亡。 国内从2009年开始PKV 阳性检出率呈逐年递增的趋势。 PKV与其他病毒混合感染现象也较普遍， 同时还会加重病 情， 其感染也 不仅仅局限于肠道， 从而导 致所谓的“疫苗使用效果 不佳”。 [0006]目前检测猪腹泻病病原的方法有病毒分离与鉴定、 血清学方法及分子生物学方法 等， 猪腹泻病引起的症状均以腹泻为特征， 仅依据临床症状和流行病学很难进 行鉴别诊断， 因此必须依靠实验室检测技术。 其中病毒分离、 血清学技术等常用诊断技术均存在操作复 杂， 难度较大等问题， 并且很难在疾病早期得出诊断结论； 而血清学方法准确 率较低， 单一 PCR方法检测效率低。 因此， 针对猪腹泻病病原建立一种敏感、 快速、 高效的能同时检测猪德 尔塔冠状病毒、 哺乳动物呼肠孤病毒和猪嵴病毒三种病原的方法是猪腹泻病病原快速鉴别 与早期防控的关键 。 发明内容 [0007]本发明的目的在于提供同时检测猪德尔塔冠状病毒、 呼肠孤病毒和猪嵴病毒的核 酸组合物、 试剂盒及检测方法， 采用本发明提供 的核酸组合物可以同时快速、 方便、 高效地说　明　书 1/12 页 3 CN 114438265 A 3