(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210246961.5 (22)申请日 2022.03.14 (71)申请人 沈阳农业大 学 地址 110866 辽宁省沈阳市沈河区东陵路 120号 (72)发明人 姜宏波　刘京慧　包杰　陈启军　 (74)专利代理 机构 沈阳铭扬联创知识产权代理 事务所(普通 合伙) 21241 专利代理师 吕敏 (51)Int.Cl. C12Q 1/6888(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12Q 1/6851(2018.01) (54)发明名称 中华小长臂虾微孢子虫绝对荧光定量PCR检 测方法、 试剂盒及引物 (57)摘要 一种中华小长臂虾微孢子虫绝对荧光定量 PCR检测方法、 试剂盒及引物， 属于分子生物学技 术领域。 具体检检测方法： 采集样本； 中华小长臂 虾微孢子虫DNA的提取； 合成扩增片段大小为 141bp的上下游引物； 绝对荧光定量PCR方法的建 立； 标准曲线的绘制； 绝对荧光定量PCR方法的灵 敏度和特异性试验。 本发明建立快速， 灵敏的中 华小长臂虾微孢子虫分子检测方法， 与传统的 PCR检测方法相比， 具有省事、 高效、 灵敏、 定量的 特点。 权利要求书1页 说明书7页 序列表1页 附图3页 CN 114592071 A 2022.06.07 CN 114592071 A 1.一种中华小长臂虾微孢子虫绝对荧光定量PCR检测的特异性引物， 其特征在于： 根据 中华小长臂虾 微孢子虫的靶基因序列， 合 成扩增片段大小为 141bp的上下游引物， 所述引物 的序列如下： 上游引物为:5 ’ ‑ATTCCCTCGTTCGTTGAGTCAGAT TG‑3’， 下游引物为： 5 ’ ‑GTGGCATTGTCATCATC CCTTTGTTG‑3’， 引物浓度有 要求为10 μM/ μL。 2.一种中华小长臂虾微孢子虫绝对荧光定量PCR检测的试剂 盒， 其特征在于： 包括权利 要求1所述的上 下游引物以及中华小长臂 虾微孢子虫质粒 标准品。 3.根据权利要求1所述的用于中华小长臂虾微孢子虫绝对荧光定量PCR检测的试剂 盒， 其特征在于： 所述中华小长臂虾微孢子虫质粒标准品由Eb99F/Eb99R引物进行扩增得到目 的片段制备而成， ‑20℃保存。 4.如权利要求1 ‑2任一项所述的引物在中华小长臂虾微孢子虫绝对荧光定量PCR检测 中的应用。 5.一种中华小长臂虾微孢子虫绝对荧光定量PCR检测方法， 其特征在于： 绝对荧光定量 PCR方法的建立： 使用2 ×ChamQ Universal  SYBR qPCR Master Mix试剂进行绝对 荧光定量 PCR方法的建立， 反应体系为20 μL， 2 ×ChamQ Universal  SYBR qPCR Master Mix 10.0 μL， 上下游引物各0.4 μL， ddH2O 7.2 μL， 模板2 μL； 加 样时先将引物和ddH2O均匀混合并分装到反 应管， 后加均匀混合好的模板和2 ×ChamQ Universal  SYBR qPCR Master Mix， 上机器前离 心处理； 反应条件为： 预变性95℃30s， 1个循环； 变性95℃10s， 退火60℃ 30s， 延伸72℃ 30s， 40个 循环。 6.根据权利要求5所述的一种中华小长臂虾微孢子虫绝对荧光定量PCR检测方法， 其特 征在于： 所述 荧光定量PCR标准曲线的绘制： (1)制备含 扩增靶序列的阳性质粒作为阳性标准品； (2)将构建标准重组质粒换算拷贝数后， 进行连续的10倍梯度稀释， 从7.7 ×100到7.7× 108共设置9个浓度梯度， 每个梯度设置6个重复， 于荧光定量PCR仪中进行扩增， 各取2 μL当 做模板， 同时设置以d dH2O为模板为阴性对照； (3)扩增结束后收集数据， 根据扩增屈曲线、 Ct值， 每个浓度重复3次进行检测， 得出最 佳的检测区间， 并绘制标准曲线。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114592071 A 2中华小长臂虾微孢 子虫绝对荧光定量PCR检测方 法、 试剂盒及 引物 技术领域 [0001]本发明属于分子生物学技术领域， 特别是涉及一种中华小长臂虾微孢子虫绝对荧 光定量PCR检测方法、 试剂盒及特异性引物。 背景技术 [0002]微孢子虫最早被报道于1857年， (Nageli  1857)， 是典型的专性胞内寄生的单细胞 真核生物， 微孢子虫自身具有着独特 的特征， 如独特的侵染装置， 孢子发芽时弹出极丝， 将 具有感染性的胞原质运输到细胞内。 国际动物命名委员会(ICZN)已确定微孢子虫门包括 200多个属(Becnel  et al.， 2014)。  Thelohania属侵染直额长臂虾(Palaemon   rectirostris)、 锯齿长臂虾  (Palaemon  serratus)和海洋褐虾(Cran gon vulgaris)和淡 水龙虾和奥斯塔欧洲鳌虾(Astacus  fluviatilis )等虾类(Edgerton  BF et al， 2002；   Stentiford  GD et al， 2013)。 [0003]Enterocytospora  artemiae(EAM)最早发现于2013年， 它 被认为是一种专性于卤 虫的寄生虫， 仅限于欧洲和美洲(Ro de等人， 2013年)。 然而， 在2020  年， 发现这种微孢子虫 已经蔓延到亚洲， 并感染了具有重要经济意义的中华小长臂虾(Jiang  et al.,2020)。 EAM 主要寄生于中华小长臂虾的肝胰腺。 EAM感染严重时会导致肝胰腺发白病变， 并大大降低中 华小长臂虾的活力， 使其生长缓慢、 发育停滞。 虽然死亡率不高， 但这些微孢子虫对宿主营 养的吸收导致繁育成本增 加。 [0004]目前， 对于EAM的检测主要有光学显微、 电子显微镜镜观察、 组织病理切片， 但是这 些技术分别使用时， 却各有其局限性。 电镜观察耗时长， 费用高并需要 具备特殊放入实验器 材视野狭窄， 感染宿主的微孢子虫数量较低时， 通过传统染色、 光学显微镜或电子显微镜进 行观察变得无效， 从而 无法准确测定各种微孢子虫。 组织病理切片虽组织结构保存良好， 在 病理和回顾性研究中有较大的实用价值， 但观察需要 大量虫体， 不适用于早期检测， 操作繁 琐， 费时费工； 常规P CR灵敏度低、 不能准确、 定量的检测EAM及其在宿 主组织中的寄生活性。 相比之下， 实时荧光定量PCR(qPCR)， 具有优势： 如高特异性和高灵敏度， 消耗更少时间， 并 可得知初始DNA模板的拷贝数。 qPCR检测过程是在一个相 对封闭、 独立的系统中完成， 防止 样品和环境的交叉污染(Kotk ová等人， 2018年； L i等人， 2019年)。 发明内容 [0005]针对上述存在的中华小长臂虾微孢子虫诊断技术检测灵敏度不高、 操作频繁、 检 测时期较晚等技术问题， 本发明提供一种中华小长臂虾微孢子虫  Enterocytospora   artemiae(EAM)绝对荧光定量PCR检测方法、 试剂盒及特异性引物， 它可以快速诊断中华小 长臂虾微孢子虫的特异性引物及SYBR  Green荧光定量PCR检测， 使得中华小长臂虾微孢子 虫检测的灵敏度和特异性得到 很大程度的增强， 并避免了漏检和误 解。 [0006]本发明的目的是通过以下技 术方案来实现的：说　明　书 1/7 页 3 CN 114592071 A 3