(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210244787.0 (22)申请日 2022.03.14 (71)申请人 桂林医学院 地址 541004 广西壮 族自治区桂林市七 星 区环城北二路109号 (72)发明人 谢方仪　邹先琼　沙远峰　廖娴　 黄子瑜　黄济东　 (74)专利代理 机构 桂林市持衡专利商标事务所 有限公司 45107 专利代理师 唐智芳 (51)Int.Cl. C12N 15/11(2006.01) C12N 15/10(2006.01) C12N 15/12(2006.01) C12N 15/63(2006.01)C12N 15/66(2006.01) C12P 19/34(2006.01) A61K 48/00(2006.01) A61P 1/02(2006.01) A61P 31/04(2006.01) (54)发明名称 免疫mRNA及其制备方法和应用 (57)摘要 本发明公开了免疫mRNA及其制备方法和应 用， 属于生物医药技术领域。 所述免疫mRNA的制 备方法， 具体是在采用体外转录合成mRNA， 其特 征是， 在体外转录合成mRNA时， 掺入5～15mol％ 的5‑甲基胞苷和5～15mol％的2 ‑硫尿苷用于化 学修饰体外转录合成。 采用本发 明所述方法制得 的免疫mRNA递送后的稳定性及蛋白合成效率得 到显著上升， 可提高其在递送后抗口腔上皮细胞 侵染的能力， 且在递送口腔上皮细胞后能减弱与 模式识别受体(TLR3、 TLR7、 TLR8及RIG ‑I)的结 合， 降低mRNA递送的免疫反应 。 权利要求书1页 说明书5页 序列表2页 附图3页 CN 114561381 A 2022.05.31 CN 114561381 A 1.化学修饰合成免疫mRNA的方法， 采用体外转录合成mRNA， 其特征是， 在体外转录合成 mRNA时， 掺入5～15mol％的5 ‑甲基胞苷和5～15mol％的2 ‑硫尿苷用于化学修饰体外转录合 成。 2.根据权利要求1所述的方法， 其特征是， 将S100A8和S100A9或者是CAMP基因开放阅读 框分别插入质粒pGEM4Z ‑2bgUTR‑64A， 获得重组质粒pGEM4Z ‑S100A8‑2bgUTR‑64A和pGEM4Z ‑ S100A9‑2bgUTR‑64A或者是p GEM4Z‑CAMP‑2bgUTR‑64A， 采用载体特异性引物对对所得重组 质粒进行扩增， 得到PCR产物； 以纯化后的PCR片段作为模板， 体外转录合成mRNA， 在体外转 录合成时， 掺入5～15mol％的5 ‑甲基胞苷和5～15mol％的2 ‑硫尿苷用于化学修饰， 采用抗 反向帽类似物加 帽， 纯化， 即得到相应的免疫mRNA； 其中， 所述的载体特异性引物对分别如 SEQ IDNO： 1和SEQ  ID NO： 2所示。 3.根据权利 要求1或2所述的方法， 其特征是， 在体外转录合成mR  NA时， 掺入10mol％的 5‑甲基胞苷和10mo l％的2‑硫尿苷。 4.根据权利要求1或2所述的方法， 其特 征是， 所述的抗反向帽 类似物为ARCA。 5.根据权利要求1～4中任一项所述方法制备 得到的免疫mRNA。 6.采用权利 要求5所述免疫mRNA递送口腔上皮细胞的方法， 其特征是， 将免疫mRNA采用 TransIT‑mRNA脂质体包裹纯化后递送口腔上皮细胞。 7.权利要求5所述的免疫mRNA在制备增强口腔上皮细胞抗病原菌侵染能力的制 剂中的 应用。 8.根据权利要求7 所述的应用， 其特 征是， 所述的抗病原菌为牙龈卟啉单 胞菌。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114561381 A 2免疫mRNA及其制备方 法和应用 技术领域 [0001]本发明涉及免疫mRNA及其制备 方法和应用， 属于生物医药技 术领域。 背景技术 [0002]mRNA是以DNA的一条链作为模板转录而来、 携带有遗传信息、 可以指 导蛋白质合成 的单链核糖核酸， 从1961年发现mRNA至2019年， 市面上尚无mRNA药物获批应用于临床。 然 而， 近十年来， mRNA 递送系统和核酸化学的不断发展推进了mRNA疗法的临床前开发， 加速了 mRNA发展成为一种新型核酸药物的进程。 2021年 获紧急授权使用的两款mRNA疫苗在新冠疫 情爆发后短 短一年时间左右便推向临床， 且保护效力超过90％， 体现了mRNA疫苗的优 越性。 [0003]牙周炎与心血管疾病、 糖尿病、 妊娠不良、 风湿性疾病、 心理疾病等全身性疾病密 切相关。 2018年第四次 “全国口腔健康流行病学调查报告 ”数据显示， 我国80～97％的成年 人存在不同程度的牙周问题。 迄今， 牙周炎已被认为是仅次于肿瘤和心血管疾病， 危害人类 健康的第三大疾病。 牙周炎的抗生素治疗会带来病原菌抗性患者过敏及非特异 性作用等问 题， 因此发展抗生素治疗的替代方法是亟待解决的问题。 自2020年初新型冠状病毒肺炎疫 情爆发以来， mRNA疫苗的应用使mRNA递送成为研究的热点。 在应用过程中， mRNA递送的不稳 定及诱发的免疫反应等问题一 直是该领域研究的热点。 [0004]现有技术中体外转录合成天然免疫蛋白mRNA(如S100A8/A9、 抗菌肽CAMP)递送口 腔上皮细胞， 能够表达出相应的蛋白， 提高其抗李 斯特菌或沙门氏菌侵染的能力， 但存在以 下不足： (1)mRNA递送的效率低； (2)递送后与细胞病原模式识别受体结合， 诱发较强的免疫 反应。 发明内容 [0005]本发明要解决的技术问题是提供递送效率高， 且可降递送的免疫反应的免疫 mRNA 及其制备 方法和应用。 [0006]为解决上述 技术问题， 本发明采用以下技 术方案： [0007]化学修饰合成免疫mRNA的方法， 采用体外转录合成mRNA， 具体是在体外转录合成 mRNA时， 掺入5～15mol％的5 ‑甲基胞苷和5～15mol％的2 ‑硫尿苷用于化学修饰体外转录合 成。 [0008]本领域公知， 在体外转录合成mRNA时需以核苷三磷酸混合物NTPs(包括腺苷三磷 酸ATP， 尿苷三磷酸UTPutp， 胞苷三磷酸CTPctp和鸟苷三磷酸GTP)为原料， 本发明所述方法 中， 所述的掺入5～15mol％的5 ‑甲基胞苷和5～15mol％的2 ‑硫尿苷是指， 核苷三磷酸混合 物中使用的尿苷由5～15mol％的2 ‑硫尿苷和95～85mol％的尿苷三磷酸组成， 使用的胞苷 则是由5～15mol％的5 ‑甲基胞苷和95～85mol％的胞苷三磷酸组成。 申请人通过试验发现， 通过掺入5～15mol％的5 ‑甲基胞苷和5～15mol％的2 ‑硫尿苷用于化学修饰体外转录合成 能够显著 提高免疫mRNA的稳定性及蛋白合成效率， 并显著增强口腔上皮细胞抗牙 龈卟啉单 胞菌(ATCC  33277)侵染的能力； 而且 该化学修饰免疫mRNA递送口腔上皮细胞后也能显著减说　明　书 1/5 页 3 CN 114561381 A 3