(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210255088.6 (22)申请日 2022.03.15 (71)申请人 广州迪澳医疗科技有限公司 地址 510000 广东省广州市黄埔区科丰路 31号G11栋602房 (72)发明人 陈皇佑　任文玉　 (74)专利代理 机构 广州博联知识产权代理有限 公司 44663 专利代理师 宋佳 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/6844(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12N 15/113(2010.01) C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 一种用于呼吸道合胞病毒检测的试剂盒及 其应用 (57)摘要 本发明涉及一种用于呼吸道合胞病毒检测 的试剂盒及其应用， 该试剂盒包括RPA扩增反应 体系和CRISPR ‑Cas13a蛋白酶检测体系； 其中， RPA扩增反应体系包括RPA扩增引物对， CRISPR ‑ Cas13a蛋白酶检测体系包括sgRNA、 Cas13a蛋白 和探针。 本发明还提供了对应的检测方法， 通过 该试剂盒在恒温条件下即可实现对呼吸道合胞 病毒的检测， 具有检测时间短、 操作 简便、 检测条 件温和、 无需昂贵的专业仪器辅助等优点。 该试 剂盒和对应的检测方法具有良好的应用前景， 有 潜力应用于临床检测。 权利要求书1页 说明书6页 序列表2页 附图2页 CN 114807435 A 2022.07.29 CN 114807435 A 1.一种用于呼吸道合胞病毒检测的试剂组合， 其特征在于， 包括RPA扩增引物对、 sgRNA、 Cas13a 蛋白和探针； 所述RPA扩增引物对选自下组中的至少一种： SEQ  ID NO： 1和SEQ  ID NO： 2所示的引物 对， SEQ ID NO： 3和SEQ  ID NO： 4所示的引物对， SEQ  ID NO： 5和SEQ  ID NO： 6所示的引物对； 所述sgRNA的序列如SEQ  ID NO： 7所示。 2.一种用于呼吸道合胞病毒检测的试剂盒， 其特征在于， 包括RPA扩增反应体系和 CRISPR‑Cas13a蛋白酶检测体系； 所述RPA扩增反应体系包括RPA扩增引物对， 所述RPA扩增引物对选自下组中的至少一 种： SEQ ID NO： 1和SEQ  ID NO： 2所示的引物对， SEQ  ID NO： 3和SEQ  ID NO： 4所示的引物对， SEQ ID NO： 5和SEQ  ID NO： 6所示的引物对； 所述CRISPR ‑Cas13a蛋白酶检测体系包括sgRNA、 Cas13a蛋白和探针； 所述sgRNA的序列 如SEQ ID NO： 7所示。 3.如权利 要求2所述的试剂盒， 其特征在于， 所述RPA扩增反应体系还包括RPA扩增反应 缓冲液和聚合酶。 4.如权利要求3所述的试剂盒， 其特征在于， 所述RPA扩增反应缓冲液包括RPA  Buffer 和Mg(CH3COO)2。 5.如权利要求3所述的试剂盒， 其特征在于， 所述PRA扩增反应体系中， 所述RPA扩增引 物对的浓度为每种引物10 ‑20 μM。 6.如权利要求2所述的试剂盒， 其特征在于， 所述CRISPR ‑Cas13a蛋白酶检测体系还包 括CRISPR‑Cas13a蛋白酶缓冲液， RNA酶抑制剂。 7.如权利要求2所述的试剂 盒， 其特征在于， 所述试剂 盒还包括阴性对照品和阳性对照 品。 8.如权利要求7所述的试剂 盒， 其特征在于， 所述阳性对照品为含有呼吸道合胞病 毒检 测目标序列的T载体； 所述阴性对照为超纯 水。 9.一种呼吸道合胞病毒的检测方法， 其特征在于， 所述检测方法应用权利要求2 ‑8任一 项所述的试剂盒进行呼吸道合胞病毒的检测， 所述检测方法包括以下步骤： (1)提取待测样本的核酸作为待测模板； (2)将所述待测模板加入所述RPA扩增反应 体系中进行扩增， 得到扩增产物； (3)将所述扩增产物加入所述CRISPR ‑Cas13a蛋白酶检测体系， 在等温条件下收集检测 信号。 10.如权利要求9所述的检测方法， 其特征在于， 所述扩增的反应温度为35 ‑45℃； 所述 扩增反演的时间为15 ‑30min； 优选地， 所述 等温条件为3 5‑45℃。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114807435 A 2一种用于呼吸道合 胞病毒检测的试剂盒及其应用 技术领域 [0001]本发明涉及 生物检测技术领域， 具体涉及 一种用于呼吸道合胞病毒检测的试剂盒 及其应用。 背景技术 [0002]呼吸道合胞病毒(Respirat ory syncytial virus,RSV)属于副黏病毒 科的肺病毒 属(Pneumovirus)。 呼吸道合胞病毒是一种单链RNA病毒， 有A、 B两个压型， 在酸碱环境中容 易失活， 在日常环 境中可存活数小时。 常通过飞沫或者密切接触传播， 北方多发在寒冷的冬 春季， 南方流行高峰期则主要在炎热的夏秋季。 主要症状表现为发热、 咳嗽、 喘息、 X线检查 为小点片状阴影。 病情 较轻的患儿一般病程在6 ‑10天， 6个月以下婴幼儿感染呼吸道 合胞病 毒后多为重症病例， 症状 类似肺炎 。 [0003]呼吸道合胞病毒是引起一岁以下婴幼儿健康问题的主要原因， 可引发危及婴幼儿 生命的下呼吸道感染， 导致婴幼儿患毛细支气管炎和肺炎， 除此之外， 呼吸道 合胞病毒亦能 感染老年人及免疫力低下的人群。 因此、 建立有效、 快速的呼吸道 合胞病毒鉴定方法对保障 婴幼儿的健康至关重要。 [0004]目前临床对呼吸道合胞病毒进行辅助的检测方法主要有酶联免疫吸附法 (ELISA)、 实时荧光定量PCR(RT ‑PCR)等。 酶联免疫吸附法检测操作复杂、 检测时间长、 交互 反应发生的机率较高、 检测费用高。 实时荧光定量P CR在检测方面与酶联免疫吸附检测法相 比， 具有操作简 便、 检测特异 性高、 灵敏度高等多 方面的优点， 但是实时荧光定量P CR法也存 在以下缺陷： 检测时间相对较长， 需要昂贵的仪器辅助配合检测， 只能在专 业设备仪器中操 作进行， 需要高温进行PCR扩增反应来达 到检测目的。 [0005]相对于PCR等需要高温条件实现核酸扩增的检测技术， 恒温扩增技术只需要一个 温度， 不需要温度循环改变， 精准的升温控温模块， 对仪器设备要求低。 目前常用的恒温扩 增手段主要包括了环介导恒温扩增(LAMP)、 依赖核酸序列扩增(NASBA)、 滚环核酸扩增 (RCA)、 链代替扩增(SDA)和重组酶聚合 酶扩增(RPA)等。 在众多恒温扩增方法中， RPA技术能 够将检测时间缩短至15 ‑30min完成， 检测可在室温下直接进行， 对实现核酸POCT检测提供 了有利的实验条件基础。 [0006]然而， 直接利用RPA技术进行检测仍存在诸多问题， 特别是假阳性问题亟待解决， 另外， RPA技 术的检测灵敏度相对于PCR技 术并未得到有效提升 。 [0007]为了克服现有技术中的上述缺陷， 本领域技术人员希望开发一种新的对呼吸道合 胞病毒进 行检测的方法， 使其同时具有检测时间短、 操作简 便、 特异性高、 灵敏性高、 检测条 件温和、 无需昂贵的专业仪器辅助等优点。 发明内容 [0008]本发明的目的在于提供一种用于呼吸道合胞病毒检测的试剂盒及其应用， 通过该 试剂盒在恒温条件下即可实现对呼吸道合胞病毒的检测， 具有检测时间短、 操作简便、 检测说　明　书 1/6 页 3 CN 114807435 A 3