(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 20221025497 7.0 (22)申请日 2022.03.15 (71)申请人 河南农业大 学 地址 450002 河南省郑州市金 水区文化路 95号 (72)发明人 杨路明　豆峻岭　杨森　朱华玉　 刘东明　牛欢欢　段世享　 (74)专利代理 机构 北京华际知识产权代理有限 公司 11676 专利代理师 袁瑞红 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/6858(2018.01) C12Q 1/6869(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 用于检测西瓜全缘叶形的SNP位点、 紧密连 锁分子标记及应用 (57)摘要 本发明属于基因工程技术领域， 具体涉及用 于检测西瓜全缘叶形的SNP位点、 紧密连锁分子 标记及应用。 本发明的分子标记能够从分子水平 鉴定西瓜叶形性状， 可以直接用于西瓜全缘叶形 材料的分子标记辅助育种， 提高育种的选择效 率， 加快育种进程； 另外利用该分子标记可获得 这两分子标记之间的物理图谱， 从而为最终西瓜 全缘叶形ClLL基因的克隆、 分子标记辅助育种体 系的建立奠定基础， 同时也为西瓜叶片发育调控 网络的研究奠定 基础。 权利要求书2页 说明书10页 序列表3页 附图2页 CN 114736979 A 2022.07.12 CN 114736979 A 1.与西瓜全缘叶形基因ClLL紧密连锁的分子标记， 其特征在于， 所述分子标记命名为 dCAPS2和/或dCAPS3， 扩增dCAPS2分子标记的引物对的上游引物序列如SEQ.ID.NO.1所示， 下游引物序列如SEQ.ID.NO.2所示； 扩增dCAPS3分子标记的引物对的上游引物序列如 SEQ.ID.NO.3所示， 下游引物序列如SEQ.ID.NO.4所示。 2.权利要求1所述与西瓜全缘叶形基因ClLL紧密连锁的分子标记在西瓜分子育种中的 应用。 3.根据权利要求2所述的应用， 其特征在于， 所述分子标记用于鉴定或辅助鉴定西瓜全 缘叶形性状。 4.一种鉴定西瓜全缘叶形性状的方法， 其特 征在于， 所述方法包括如下步骤： (1)提取西瓜植株组织的DNA； (2)PCR扩增： 利用权利要求1所述的引物对， 对步骤(1)所提取样品进行PCR扩增； (3)对步骤(2)中的扩增产物进行酶切处 理， 之后进行电泳检测； (4)根据步骤(3)的电泳条 带结果进行判定， 具体标准 为： 对于分子标记dCAPS2， 如果酶切产物为长度122bp的特征条带， 则 待测西瓜植株为全缘 叶形的西瓜材料， 如果 酶切扩增产 物为146bp的特征条带， 该待测西瓜植株为纯合裂刻叶形 的西瓜材料， 如果 酶切产物 为两条长度分别为146b p、 122bp的特征条带， 该待测西瓜植株为 杂合裂刻叶形的西瓜材 料； 对于分子标记dCAPS3， 如果酶切产物为长度119bp的特征条带， 则 待测西瓜植株为全缘 叶形的西瓜材料， 如果酶切扩增产物为89bp的特征条带， 该待测西瓜植株为纯合裂刻叶形 的西瓜材料， 如果酶切产物为两条长度分别为119bp、 89bp的特征条带， 该待测西瓜植株为 杂合裂刻叶形的西瓜材 料。 5.根据权利 要求4所述的方法， 其特征在于， 步骤(2)所述PCR扩增的反应体系为： DNA  1 μL、 2×PCR Mix 5 μL、 上游引物0.5 μL、 下游引物0.5 μL、 灭菌蒸馏水3 μL， 总体积 10 μL； PCR扩 增条件为： 95℃、 5min； 94℃、 30s， 57℃、 30s， 72℃、 50s， 共35个循环； 72℃、 10min； 4℃保存； 步骤(3)中所述的酶切反应体系为： PCR产物5 μL， 10X  buffer1.5 μL， Dde1限制性内切酶0.5 μ L， 灭菌蒸馏水3.5 μL， 总体积10 μL。 酶切条件为37℃、 4h 。 6.一个用于检测西瓜全缘叶形的SNP位点， 其特征在于， 所述SNP位点为西瓜基因组4   号染色体上第2123 3313位核苷酸T缺失。 7.一对用于检测西瓜全缘 叶形性状的SNP2标记， 其特征在于， 扩增所述SNP2标记的引 物对的上游引物序列如SEQ.ID.NO.9所示， 下游引物序列如SEQ.ID.NO.10所示。 8.一种鉴定西瓜全缘叶形性状的方法， 其特 征在于， 所述方法包括如下步骤： (1)提取西瓜植株组织的DNA； (2)PCR扩增： 利用权利要求7 所述的引物对， 对步骤(1)所提取样品进行PCR扩增； (3)对产物进行sanger测序 (4)根据步骤(3)的测序结果进行判定， 具体标准 为： 若克隆产物第253至258位碱基为GTTTCC， 其序列如序列表中SEQ  ID NO.11所示， 则待 测西瓜植株为全缘叶形的材料； 若克隆产物第253至258位碱基为GTTTTC， 其序列如序列表 中SEQ ID NO.12所示， 则待测西瓜植株为纯合裂刻叶形材料； 若克隆产物第253至258位碱 基为GTTTCC或GTTTTC， 待测西瓜植株为杂合裂刻叶形 材料。权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114736979 A 29.一种用于鉴定西瓜全缘叶形性状的试剂 盒， 其特征在于， 包含权利要求1中所述的一 对或者两对引物对或包 含权利要求7中所述的引物对。 10.用于检测dCAPS标记或SNP2标记是否存在的试剂在全缘叶形基因ClLL定位中的应 用， 其特征在于， 扩增所述 dCAPS2标记的引物对的上游引物序列如SEQ.ID.NO.1所示， 下游 引物序列如SEQ.ID.NO.2所示； 和/或扩增所述dCAPS3标记的引物对的上游引物序列如 SEQ.ID.NO.3所示， 下游引物序列如SEQ.ID.NO.4所示； 扩增所述SNP2标记的引物对的上游 引物序列如SEQ.ID.NO.9所示， 下游引物序列如SEQ.ID.NO.10所示。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114736979 A 3