(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210254251.7 (22)申请日 2022.03.15 (71)申请人 中国动物卫 生与流行病学中心 地址 266032 山东省青岛市 市北区南京路 369号 (72)发明人 樊晓旭　张浩博　刘婷婷　亓菲　 孙翔翔　刘蒙达　田莉莉　孙明军　 董雅琴　焉鑫　付树芳　孙世雄　 迟庆安　冯淑芳　仵国政　张培培　 魏润宇　王毓秀　邵卫星　孙淑芳　 范伟兴　 (74)专利代理 机构 北京识然知识产权代理事务 所(普通合伙) 11975 专利代理师 曾庆国(51)Int.Cl. C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/6844(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/32(2006.01) (54)发明名称 一种快速 检测牛结核病的方法 (57)摘要 本发明公开了一种通用快速检测牛结核病 的引物、 探针及检测方法， 其中引物和探针适用 于RAA荧光法检测， 可实现在39℃条件下20分钟 内完成动物布鲁氏菌核酸的检测； 与猪链球菌、 沙门氏菌、 金黄色葡萄球菌、 巴氏杆菌、 大肠杆 菌、 布鲁氏菌核酸样本无交叉反应， 特异性达 100％； 检测方法快速、 容易实现高通量， 同时降 低了检测时间和检测成本， 本发明提供的基于 RAA荧光法通用快速检测牛结核病病原的方法， 灵敏度高， 反应检测灵敏度在9 5％的概率下达到 66copies/反应 。 权利要求书1页 说明书9页 附图3页 CN 114657271 A 2022.06.24 CN 114657271 A 1.一种快速检测牛结核病的扩增用引物对和探针， 其特征在于， 所述引物对用于检测 序列为SEQ  ID NO:1的片段， 探针 检测所述引物扩增的产物。 2.如权利要求1所述的扩增用引物和探针， 其特征在于， 所述的引物对中的上游引物的 序列为SEQ  ID NO： 2； 下游引物的序列为SEQ  ID NO： 3。 3.如权利要求1所述的扩增用引物和探针， 其特征在于， 所述的探针的序列为SEQ  ID  NO： 4。 4.如权利要求3所述的扩增用引物和探针， 其特征在于， 所述的探针的所述探针采用荧 光报告基团和荧 光淬灭基团进行修饰。 5.如权利要求4所述探针采用荧光报告基团和荧光淬灭基团进行修饰， 荧光报告基团 修饰在探针序列离5 ′端碱基数30bp的位置上； 荧光淬灭基团修饰在探针序列离3 ′端碱基数 18bp的位置上， 荧光报告基团与淬灭基团之间间隔了3个碱基CAG， 其中A用四氢呋喃残基替 换。 6.如权利要求5所述的扩增用引物和探针， 其特征在于， 所述的述荧光报告基团为FAM； 荧光淬灭基团为BHQ1。 7.一种RAA荧光检测试剂盒， 其特征在于， 所述的试剂盒中包含有权利要求1 ‑6任一项 所述的扩增用引物和探针。 8.一种基于重组酶等温扩增荧光法快速检测动物布鲁氏菌病的方法， 其特征在于， 所 述的方法包括如下的步骤： 1)提取待检测对象的核酸样品； 2)将恒温荧光基因检测仪接通电源进行预热， 对反应参数进行设置； 反应参数设置为 39℃， 反应时间： 20分钟； 3)在25 μL反应缓冲液中加入13.7 μL水， 浓度为15 μM的2.1μL权利要求1 ‑6任一项所述的 扩增用引物和 0.6 μL探针， 充分混合后添加 到RAA荧光基础反应试剂中混合， 得到反应预混 液； 4)在反应管盖上加2.5μL的Mg2+， 将4μL所述步骤1)中得到的核酸样品与所述步骤3)中 得到的反应预混液充分 混合， 得到的反应 体系放入恒温荧 光基因检测仪检测荧 光信号； 5)根据RAA ‑F1610检测仪器中的阳性判定方法， 选择阈值的方法来判定曲线的阴阳性； 在设置自动阈值为300， 定性阈值为200， 则在20分钟内， 荧光值大于300的孔位会被判定为 阳性， 其余判定为阴性。 9.如权利要求8所述的方法， 其特征在于， 所述的上游引物和下游引物的使用浓度为1 ～50 μM； 探针的浓度为1～5 0 μM。 10.如权利要求8所述的方法， 其特征在于， 所述的上游引物和下游引物的使用浓度为 10 μM； 探针的浓度为10 μM 。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114657271 A 2一种快速检测牛结核病的方 法 技术领域 [0001]本发明属于细菌分子生物学检测技术领域， 具体涉及一种对牛结核病病原的快速 检测方法。 背景技术 [0002]牛结核病(Bovine  Tuberculosis， bTB)是由牛分枝杆菌(Mycobacterium  bovis， M.bovis)等引起的一种人兽共患的慢性传染病， 我国将其列为二类动物疫病。 以组织器官 的结核结节性肉芽肿和干酪样、 钙化的坏死病灶为特征。 世界动物 卫生组织(OIE)将其列为 必须通报的动物疫病(notifiable  diseases)。 2012年， 我国发布 《国家中长期动物疫病防 治规划(2012—2020年)》 ， 将牛结核病列为16种优先防治动物疫病病种。 《国家奶牛结核病 防治指导意见(2017 ‑2020年)》 进一步提出了牛结核病的控制目标。 据估计， 全世界有超过 5000万头牛感染， 每年耗费30亿美元。 人通过食用未经消毒的牛奶 或与患病动物接触， 感染 牛结核病。 [0003]牛结核病通常呈慢性经过， 潜伏期在半月至数年不等。 大多数情况下， 细菌以休眠 状态潜伏在动物体内， 不引起任何临床症状， 表现为潜伏感染。 有的动物在感染几个月甚至 数年后， 才出现明显的临床症状， 发展为活动性结核。 牛结核病病原菌会侵染易感动物几乎 所有的组织器官， 因患病器官不同， 表现出来的临床症状亦不同。 整体上， 患病动物表现出 明显的食欲不振， 顽固性腹泻， 渐进性消瘦， 易疲劳， 偶尔出现波浪热， 间歇性咳嗽， 部分个 体伴随淋巴结肿大。 全国牛结核病专项调查显示， 其感染率波动上升趋势， 屠宰环节的检出 率更高。 奶牛结核病高感染率严重威胁奶业安全和公共卫生安全， 其控制净化工作任务非 常艰巨。 受制于检测技术的瓶颈， 我国牛结核病检测的需求， 特别是在现场快速检测的需求 缺口越来越大。 因此， 加强牛结核病检测技术研究， 为疫病的控制、 净化， 动物健康， 公共卫 生安全具有重要意 义。 [0004]目前对牛 结核病的诊断方法有如下的几种： [0005]1)临床诊断 [0006]牛结核病以肺结核最为常见， 其次是乳房结核和肠结核， 以及淋巴结核、 胸膜结核 和腹膜结核， 有时可见肝、 脾、 肾、 生殖器官、 脑、 骨和关节结核， 严重者可表现为全身性 粟粒 性结核。 根据感染累及器官不同， 通常可见呼吸症状、 腹泻、 泌乳减少、 生殖性能紊乱、 神经 症状等。 [0007]2)实验室诊断 [0008]牛结核实验室诊断包括细菌学方法、 免疫学方法、 分子生物学方法。 牛分枝杆菌的 分离、 培养是牛结核病诊断的金标准， 特异性好， 但缺乏敏感性， 且通常需要4 ‑8周时间。 直 接涂片法的特异 性不如细菌 分离培养法。 结核菌素皮内变态反应试验是国际贸易指定的检 测方法。 分为尾褶结核菌素皮内检测(CFT)、 颈部单一结核菌素皮内试验(SICT)以及颈部比 较结核菌素皮内试验(SICCT)。 该方法对操作人员要求较低、 成本低， 适于牛结核病 早期诊 断。 但是耗时长， 需要间隔72h测量皮厚， 劳动强度大、 主观判断性强、 易与 非结核分枝杆菌说　明　书 1/9 页 3 CN 114657271 A 3