(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210251067.7 (22)申请日 2022.03.15 (71)申请人 珠海市丽拓生物科技股份有限公司 地址 519040 广东省珠海市金湾区红旗 镇 永安三路35号 申请人 湖南省丽拓生物科技有限公司 (72)发明人 雍学安　 (74)专利代理 机构 天津三元专利商标代理有限 责任公司 12 203 专利代理师 胡畹华 (51)Int.Cl. C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/6844(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/32(2006.01) (54)发明名称 基于双切口分子信标等温核酸扩增检测核 分枝杆菌复合群的方法 (57)摘要 本发明提供了检测MPB64基因的物质在制备 用于检测结核分枝杆菌复合群的产品中的应用， 通过双切口分子信标等温核酸扩增方法， 能够实 时、 快速、 高特异性检测样品中少量的结核分枝 杆菌复合群。 本发明还提供了一种检测MPB64基 因的物质和快速检测结核分枝杆菌复合群的试 剂盒以及检测方法。 权利要求书1页 说明书6页 附图1页 CN 114836552 A 2022.08.02 CN 114836552 A 1.检测MPB64基因的物质在制备用于检测结核分枝杆菌复合群的产品中的应用， 其特 征在于， 检测MPB64基因的物质通过双切口分子信标等温核酸扩增 检测结核分枝杆菌复合 群。 2.根据权利要求1所述的应用， 其特征在于： 检测MPB64基因的物质为检测MPB64基因的 引物和分子信标， 引物包含引物B1、 引物P1、 引物P2， 分子信标为MPB64 ‑信标， 引物B1为 MPB64‑B1， 引物P1为MPB64 ‑P1， 引物P2为MPB64 ‑P2。 3.根据权利要求2所述的应用， 其特征在于： MPB64 ‑B1、 MPB64 ‑P1、 MPB64 ‑P2、 MPB64 ‑分 子信标的碱基序列分别为： MPB64‑B1:5’ ‑CGATAATCGGCGC‑3’； MPB64‑P1:5’ ‑TGCCGACACGCT TGTCAC‑CCTCAGC‑TCGCGCCGATGGCCTATG‑3’； MPB64‑P2:5’ ‑ACGACGTGC CGAT‑3’； MPB64‑信标:5’‑FAM‑AGGTAGTAGCCTCT ‑CCTCAGC ‑ACTCCGAATCTCCT ‑ CCTCAGCAAACTATACA ACCTACTACCT‑DABCYL‑3’。 4.根据权利要求3所述的应用， 其特征在于： 所述分子信标的5 ’端用FAM标记， 3 ’端用 DABCAL标记。 5.根据权利要求4所述的应用， 其特征在于： 检测结核分枝杆菌复合群的产品为试剂 盒。 6.根据权利要求1所述的应用中使用的检测MPB64基因的物质。 7.检测结核分枝杆菌复合群的试剂盒， 其特征在于： 包括下述反应液试剂成分： 1μL引 物B1、 1μL引物P1、 1μL引物P2、 1μL  dNTPs、 1μL  Bst聚合酶、 1μL切刻内切酶、 10μL  Buffer、 0.5 μL分子信标， 其 余为去离子水。 8.根据权利要求7所述的试剂盒， 其特征在于： Buffer包含20mM  Tirs、 20mM  KCl、 2mM  MgSO4、 10mM(NH4)2SO4。 9.利用权利要求7所述的试剂盒非疾病诊断目的地检测结核分枝杆菌复合群的方法， 其特征在于： 包括如下步骤： (1)向待测样本中加入2～3倍体积的4％NaOH溶液， 震荡混匀后， 静置液化30min。 取液 化后的样本600u L于1.5mL离心管， 12 000r/min,离心3min， 吸除上清； 加入1mL无菌生理盐水 重悬沉淀1000/min离心3min， 吸除上清； 加入50uL核酸释放剂， 100℃处理15min， 12000r/ min， 离心3mi n,上清作为待测样本备用； (2)试剂准备： 取出所述试剂盒中的各组分， 室温放置， 待温度平衡至室温， 混匀后备 用； (3)根据待测样本、 阴性对照、 阳性对照按所需比例取相应量， 配制N+2个反应的反应混 合液， 充分 混匀离心， 分装到 离心管中； (4)每个PCR反应管中依次加入待测样本、 阴性对照和阳性对照各5uL， 盖上管盖， 4000rpm离心 20秒； (5)将PCR反应管放入 扩增仪样槽， 37℃恒温检测45mi n。 10.根据权利要求9所述的方法， 其特征在于： 待检测 的样本包括： 痰、 咽拭子、 胃灌洗 液、 支气管灌洗液、 活体组织、 吸引物、 咳出物、 血液、 脓液、 骨髓、 尿液、 组织切片、 食物样 本、 来自土壤、 空气和水的样本， 以及它 们的培养物。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114836552 A 2基于双切口分子信标等温核酸扩增检测核分枝杆菌复合群的 方法 技术领域 [0001]本发明属于分子生物学领域， 特别涉及一种检测结核分枝杆菌复合群的方法和试 剂盒， 基于双切口分子信标等温核酸扩增， 快速检测样品中少量的结核分枝杆菌复合群。 背景技术 [0002]结核病主要是由结核分枝杆菌复合菌群(Mycobacterium  tuberculosis   Complex， MTC)引起。 目前国内常用的结核分枝杆菌复合菌群检测手段主要有痰涂片、 痰培 养方法和X光方法检测。 X ‑光法结果易受其他疾病干扰， 容易造成误判。 痰涂片只有当标本 中含103～105菌/ml时方能检出,发现率极低。 而痰培养方 法作为结核诊断手段的 “金标准”， 被广泛使用， 但 其耗时长(常需2个月)、 操作复杂的特点， 越来越为人所诟病， 不利于结核的 早期防治。 [0003]随着基因诊断技术的不断发展， 国内外许多研究人员将基 因检测技术引入到结核 分枝杆菌的诊断体系中来。 聚合 酶链式反应技术(P CR)自198 5年问世以来， 以其灵敏性和快 速性在医学和分子生物学等领域得到广泛的应用， 但荧光定量P CR扩增反应时间长， 在 扩增 过程中容易出现假阳性的结果； 而且荧光定量P CR仪结构复杂造价昂贵， 且需要专 业操作人 员， 没有在基层医疗机构得到普遍使用， 为了解决以上问题， 急需一种灵敏度更高、 更快速 的检测手段， 以弥补上述检测方法的不足， 同时在现场快速实时检测诊断方面有更广泛的 应用， 可用于转基因、 水产病害、 疾病检测等领域。 发明内容 [0004]本发明的目的在于提供一种检测MPB 64基因的物质在制备用于检测结核 分枝杆菌 复合群的产品中的应用， 通过双切口分子信标等温核酸扩增方法， 能够实时、 快速、 高特异 性检测样品中少量的结核分枝杆菌复合群。 [0005]本发明提供了一种检测MPB64基因的物质在制备用于检测结核分枝杆菌复合群的 产品中的应用， 其特征在于， 所述检测MPB64基因的物质通过双切口分子信标等温核酸扩增 检测结核分枝 杆菌复合群， 所述检测MPB64基因的物质优选为检测MPB64基因的引物和分子 信标， 所述引物优选包 含引物B1、 引物P1、 引物P2， 所述分子信标优选为MPB64 ‑信标， [0006]进一步地， 所述引物B1优选为MPB64 ‑B1， 引物P1优选为MPB64 ‑P1， 引物P2优选为 MPB64‑P2， MPB64 ‑B1、 MPB64 ‑P1、 MPB64 ‑P2、 MPB64 ‑信标的碱基序列分别为： [0007]MPB64‑B1:5’ ‑CGATAATCGGCGC‑3’ [0008]MPB64‑P1:5’ ‑TGCCGACACGCT TGTCAC‑CCTCAGC‑TCGCGCCGATGGCCTATG‑3’ [0009]MPB64‑P2:5’ ‑ACGACGTGC CGAT‑3’ [0010]MPB64‑信标:5’ ‑FAM‑AGGTAGTAGC CTCT‑CCTCAGC‑ACTCCGAAT [0011]CTCCT‑CCTCAGCAAACTATACA ACCTACTACCT‑DABCYL‑3’ [0012]进一步地， 所述分子信标的5 ’端用FAM标记， 3 ’端用DABCAL标记。说　明　书 1/6 页 3 CN 114836552 A 3