(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210249901.9 (22)申请日 2022.03.15 (71)申请人 福建省农业科 学院植物保护研究所 地址 350013 福建省福州市新店镇埔党村 (72)发明人 谢世勇　王荣波　季洁　黄建成　 (74)专利代理 机构 福州元创专利商标代理有限 公司 35100 专利代理师 林文弘　蔡学俊 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/686(2018.01) C12Q 1/04(2006.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 检测薏苡叶斑病菌的D PO-PCR引物及方法 (57)摘要 本发明公开了一种检测薏苡叶斑病菌的 DPO‑PCR引物及方法， 提供一种薏苡叶斑病菌高 度特异的DPO ‑PCR检测引物以及建立了基于琼脂 糖凝胶电泳判定的DPO ‑PCR检测。 本发明设计一 对双启动寡核苷酸引物（dual ‑priming   oligonucleotide， DPO） PCR检测引物， 对带菌的 薏苡叶片和种子进行检测， 以扩增产物有无和片 段大小来确定病原菌是否为薏苡叶斑病。 针对现 有技术中薏苡叶斑病菌的生物学检测方法所需 周期长、 检测方法特异性差， 灵敏度低的问题， 本 发明提供的DPO ‑PCR检测方法较传统检测方法相 比， 操作简便、 结果 准确。 权利要求书1页 说明书5页 序列表1页 附图2页 CN 114457190 A 2022.05.10 CN 114457190 A 1.一种用于薏苡叶斑病菌检测的DPO ‑PCR引物， 其特征在于： 所述DPO ‑PCR引物的核苷 酸序列如下： CcDPO‑F： 5’ ‑CCATTGATCCAGTGTGTATCA AAGCIIIIITAACTGCAG‑3’， CcDPO‑R： 5’ ‑GTGCAGCTC CGCCAATGAGTGAI IIIITTCCAGC‑3’； 其中， I代表次黄嘌呤， 可以与  A、 C、 G、 T 配对。 2.一种检测薏苡叶斑病菌的DPO ‑PCR方法， 其特征在于： 利用权利要求1所述的引物进 行DPO‑PCR检测。 3.根据权利要求2所述的方法，  其特征在于： 包括以下步骤： 1） 提取待测薏苡样品中的DNA； 2） 以步骤1） 中提取的DNA为模板， 进行D PO‑PCR扩增反应； 3） 分析扩增产物。 4.根据权利要求3所述的方法， 其特征在于： 所述DPO ‑PCR反应体系以20 μL计为： CcDPO ‑ F与CcDPO ‑R各0.2  µM， 2×Taq PCR Master Mix 10 μL， 25 ng DNA模板， 用无菌双蒸水补 足； 所述DPO ‑PCR反应程序为： 94℃  预变性 5 min； 94℃  30s， 58℃  30s， 72℃  20s， 28个循 环； 72℃ 5 min； 12℃ forever。 5.根据权利要求3所述的方法， 其特征在于： 取5  μL扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检 测， 如出现大小约为20 0 bp单一条 带判断为阳性， 没有出现则判断为阴性。 6.如权利要求1所述的DPO ‑PCR引物在薏苡叶斑病的早期诊断和病菌的监测和鉴定中 的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114457190 A 2检测薏苡叶斑病菌的DPO ‑PCR引物及方 法 技术领域 [0001]本发明属于植物保护技术领域， 具体涉及一种检测薏苡叶斑病菌的DPO ‑PCR引物 及方法。 背景技术 [0002]薏苡 （Coix lacryma ‑jobi L）， 又名薏苡仁、 薏苡、 苡米、 苡仁等， 属禾本科 Gramineae薏苡属 Coix， 是我国传统的药食兼用的食品， 具有利水渗湿、 清肺热、 健脾胃等作 用。 薏苡在我国福 建、 贵州、 云南以及广西等地均有种植。 由于薏苡种 仁具有丰富的营养价 值及药用功效， 薏苡的需求 量急剧上升， 种植 规模不断扩大。 [0003]近年来我国福建薏苡叶斑病 发病严重， 发病初期引起水渍状浅黄色病斑， 严重时 造成黄褐色病变直至死亡。 经鉴定该病是由 Curvularia coicis Castellani侵染薏苡叶片 引起的薏苡叶斑病  (Coix leaf blight, CLB) ， 是薏苡产区重要的真菌病害， 田块病株率 高达80 %以上， 造成产量下降， 严重制约薏苡的生产。 [0004]薏苡叶斑病是一种真菌型病害， 传统检测植物病原真菌 的方法不仅费时费力， 且 对于发病症状相似的病害难以做出准确的判断。 因此， 快速、 准确、 灵敏的作物病害检测技 术成为研究的重点。 双启动寡核苷酸引物 （dual ‑priming oligonucleotide， DPO） 是一种新 型的PCR引物设计方法， DPO引物结构特殊， 具有比常规PCR引物更强的特异性。 此外， DPO引 物设计简单， 退火温度范围宽， 设计中不需要反复优化引物的各项参数， 尤其是退火温度， 大大简化了PCR引物设计和反应条件优化步骤。 利用DPO ‑PCR检测引物， 建立薏苡叶斑病菌 快速、 简便、 特异性强、 灵敏度高的监测技术体系， 对于薏苡叶斑病菌引起病害显症之前 的 早期监测， 确定病害防治最佳时期具有十分重要的意 义。 发明内容 [0005]本发明的目的是针对现有技术中薏苡叶斑病菌的生物学检测方法所需周期长、 检 测方法特异 性差， 灵敏度低的问题， 而提供一种对薏苡叶斑病菌高度特异的DPO ‑PCR检测引 物， 并建立 一种基于琼脂糖凝胶电泳判定的D PO‑PCR检测方法。 [0006]为实现上述的目的， 本发明主 要采取以下技 术方案： 1． DPO‑PCR引物的设计 以薏苡叶斑病菌的甘油 ‑3‑磷酸脱氢酶基因 （ GPDH） 作为检测靶标， 通过与其它同 属的12种真菌 （其中具体包括穗状弯孢， 新月弯孢， 棒弯孢， 甘薯黑斑病菌， 黄瓜枯萎病菌， 尖孢镰刀菌， 番茄早疫病菌， 拟盘多毛孢， 核盘菌， 辣椒疫霉， 瓜果腐霉和间型腐霉） ， 进 行多 重序列比对， 选取薏苡叶斑病菌中特异区域核酸序列采用Primer  Premier 6软件设计一对 DPO‑PCR检测引物， 引物序列为： CcDPO‑F： 5’ ‑CCATTGATCCAGTGTGTATCA AAGCIIIIITAACTGCAG‑3’， CcDPO‑R： 5’ ‑GTGCAGCTC CGCCAATGAGTGAI IIIITTCCAGC‑3’； 其中， I代表次黄嘌呤， 可以与  A、 C、 G、 T 配对。说　明　书 1/5 页 3 CN 114457190 A 3