(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210252240.5 (22)申请日 2022.03.15 (71)申请人 天津国际旅行卫 生保健中心 （天津 海关口岸门诊部） 地址 300456 天津市滨 海新区塘沽区新港2 号路2-1126号 (72)发明人 祁军　潘娟　刘寅　万里　 (74)专利代理 机构 天津合正知识产权代理有限 公司 12229 专利代理师 王雨杰 (51)Int.Cl. C12Q 1/6806(2018.01) C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01)C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 基于限制性核酸内切酶的通用型探针以及 其应用 (57)摘要 本发明提供了基于限制性核酸内切酶的通 用型探针以及其应用， 所述通用型探针为由茎结 构域和位于茎结构域两端的环结构域组成的双 发卡结构； 茎结构域包含反向互补的上链和下 链， 上链中包含限制性核酸内切酶的酶切位点区 域， 下链包含自我结合区域， 自我结合区域由多 个G构成； 环结构域包含特定目标模板识别片段 区域， 特定目标模板识别片段区域为与目标序列 反向互补序列。 本发明所述的通用型探针能够实 现针对不同的检测对象只补 充识别序列， 而无需 变更骨架的其他序列就能够完成探针 设计， 从而 降低探针设计难度， 拓展应用领域。 权利要求书1页 说明书7页 序列表2页 附图6页 CN 114517222 A 2022.05.20 CN 114517222 A 1.一种基于限制性核酸内切酶的通用型探针， 其特征在于： 所述通用型探针为由茎结 构域和位于 茎结构域两端的环结构域组成的双发卡结构； 茎结构域包含反向互补的上链和下链， 上链中包含限制性核酸内切酶的酶切位点区 域， 下链包 含自我结合区域， 自我结合区域含有 多个G； 环结构域包含特定目标模板识别片段区域， 特定目标模板识别片段区域为与目标序列 反向互补序列； 当有目标序列存在时， 通用型探针识别目标序列 上的特异性序列并与其互补配对形成 双链结构， 同时上链自身折叠形成双链结构， 上链折叠形成的双链结构 中具有限制性核酸 内切酶的酶切位 点； 当没有目标序列存在时， 通用型探针保持双发卡结构。 2.根据权利要求1所述的基于限制性核酸内切酶的通用型探针， 其特征在于： 通用型探 针的5端标记荧 光基团， 3端标记淬灭基团荧 光或5端标记淬灭基团， 3端标记荧 光基团。 3.根据权利要求2所述的基于限制性核酸内切酶的通用型探针， 其特征在于： 荧光基团 为FAM或Cy5， 淬灭基团荧 光为BHQ1或BHQ2。 4.根据权利要求1所述的基于限制性核酸内切酶的通用型探针， 其特征在于： 目标序列 为DNA分子或RNA分子 。 5.一种检测新型冠状肺炎病毒的双发卡探针， 其特征在于： 所述双发卡探针的序列为 SEQ ID NO:1‑SEQ ID NO:3中任一种。 6.基于限制性核酸内切酶的单链RNA病毒的恒温检测试剂， 其特征在于： 包括酶切检测 缓冲体系， 所述 酶切检测缓冲体系包括权利要求 1‑3中任一所述的通用型探针、 限制性核酸 内切酶、 限制性核酸内切酶配套的缓冲液以及待检测核酸样本 。 7.根据权利要求6所述的基于限制性核酸内切酶的单链RNA病毒的恒温检测试剂， 其特 征在于： 所述通用型探针的反应终浓度为0.1μmol/L， 限制性核酸内切酶含量为100units/ ml。 8.一种应用权利要求6或所述的恒温检测试剂进行单链RNA病毒的恒温检测方法， 其特 征在于： 包括如下步骤： 将通用型探针、 限制性核酸内切酶、 缓冲液以及待检测核酸样本混合后得到检测混合 物； 将检测混合物在55℃ ‑65℃下使用恒温装置孵育该检测混合物30min， 反应温度参考该 检测混合物中限制性核酸内切酶的最适反应温度； 孵育结束后抽取部 分溶液加入扩增检测 缓冲液再使用琼脂糖凝胶电泳， 辨认各个条带， 如果出现较多切割 条带则证明待检测核酸 样品中存在着检测目的片段， 反 之则证明待检测核酸样本中不存在检测目的片段。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114517222 A 2基于限制性核酸内切酶的通用型探针以及其应用 技术领域 [0001]本发明创造属于基因技术领域， 尤其是涉及基于限制性核酸内切酶的通用型探针 以及其应用。 背景技术 [0002]准确的筛查方法以及有效的治疗对于预防和控制传染病非常重要。 基于核酸检测 技术的临床诊断具有灵敏度高、 特异性强的特点， 在控制疫情方面发挥着越来越重要的作 用。 例如， 实时PCR被广泛应用于新冠状病毒的测定 。 [0003]核酸检测越方便、 快速， 就能更好地预防和控制传染病。 实时PCR技术耗时长、 设备 依赖性强， 限制了其应用。 与实时PCR相比， 环介导等温扩增(LAMP)和滚环扩增技术(RCA)等 核酸等温扩增检测技 术降低了对设备的要求， 缩短了检测时间。 [0004]近年来， 快速检测技术(如Abbott  Molecular,Inc.)已在COVID ‑19诊断中得到应 用。 ID NOW系统基于缺口内切酶扩增反应(NEAR)。 在NEAR技术中， 它的关键分子是两个引 物。 上游引物和下游引物， 引物分成两部分， 一个部分用于识别模板并与之结合扩增， 另一 个部分含有酶切位点。 模板不能含有酶切位点。 两个引物扩增模板形成的复合物， 具有完整 的酶切位点。 然而， 模板结合与探针中的酶识别位点重叠。 这意 味着DNA缺口内切酶的酶识 别位点应该在病原体的基因 组上找到， 这限制了NEAR的应用。 [0005]所有上述检测均以DNA分子为靶点， 以DNA聚合酶为基础。 在RNA检测中， 它们需要 一个反向转录步骤， 这增加了复杂性， 并影响了灵敏度和特异性。 目前， 近年来的传染病主 要是由RNA病毒引起的。 在我们之前的研究中， 我们开发了内切酶依赖分子信标分析 (DEMBA)， 它显示了直接检测RNA的潜力。 DEMBA探针出现一个DNA内切酶识别位点， 当它 与目 标分子结合时， 无论是DNA还是RNA， 都可以被消化。 众所周知， DNA内切酶的数量远大于DNA 缺口内切酶。 此外， 识别位点和模板结合位点在D EMBA探针中是独立的， 这使 得DEMBA易于执 行。 但是当DEMBA探针与目标结合时， 它应该保持一个正确的二级结构， 这导致DEMBA探针和 近探针的设计都很困难。 发明内容 [0006]有鉴于此， 本发明旨在克服现有技术中的缺陷， 提出基于限制性核酸内切酶的通 用型探针以及其应用。 [0007]为达到上述目的， 本发明的技 术方案是这样实现的： [0008]作为本发明的第一方面的发明目的， 本发明提供一种基于限制性核酸内切酶的通 用型探针， 所述通用型探针为由茎结构域和位于茎结构域两端的环结构域组成的双发卡结 构； [0009]茎结构域包含反向互补的上链和下链， 上链中包含限制性核酸内切酶的酶切位点 区域， 下链包 含自我结合区域， 自我结合区域由多个G构成； [0010]环结构域包含特定目标模板识别片 段区域， 特定目标模板识别片段区域为与目标说　明　书 1/7 页 3 CN 114517222 A 3