(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210258063.1 (22)申请日 2022.03.16 (71)申请人 新疆农业大 学 地址 830052 新疆维吾尔自治区乌鲁 木齐 市沙依巴克区南昌路42号 (72)发明人 史慧君　付强　李丹　马雪连　 姚刚　杨莉　陈俊贞　李泽宇　 贺渊秀　董文丽　 (74)专利代理 机构 西安鼎迈知识产权代理事务 所(普通合伙) 6126 3 专利代理师 刘喜保 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01)C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 一种同时检测BCoV和BRV的试剂盒及其应用 (57)摘要 本发明提供一种同时检测BCoV和BRV的试剂 盒， 针对BCoV和BRV基因序列发明了特异性引物 和探针， 并且可以同时检测BCoV和BRV； 所述试剂 盒具有高灵敏度， 能够直接定量， 自动分析出结 果， 不依赖Ct值， 不用建立标准曲线； 快速高效、 操作简便、 重复性好的优点， 可 以对低丰度的目 的基因进行检测的特点， 通过临床试验对比现有 的qPCR检测， BCoV检出阳性样本9个， 阳性率为 10.98％； BRV检出阳性样本10个， 阳性率为 12.2％。 而采用本申请提供试剂盒检出BCoV阳性 样本15个， 阳性率为18.29％； BRV检出阳性样本 12个， 阳性率为14.63％； BCoV和BRV混合感染检 出阳性样本5个， 阳性率为6.1％。 通过应本申请 提供的检测试剂盒， 为有效防控BCoV和BRV提供 技术支持， 对于养牛业具有巨大的潜在开发价 值。 权利要求书1页 说明书8页 附图2页 CN 114774583 A 2022.07.22 CN 114774583 A 1.一种同时检测BCoV和BRV的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒中含有特异性引物和探 针组合， 包括以下2对特异性引物和2条 特异探针， 其核苷酸序列分别为： BCOV上游引物： 5 ’ ‑GATCTACT TCACGCGCATC C‑3’， BCOV下游引物： 5 ’ ‑GTGGCTTAGTGGCATCCTTG‑3’， BCOV探针： 5 ’ ‑FAM‑TGGCTCTACTGCGCGATC CTGCA‑BHQ1‑3’； BRV上游引物： 5 ’ ‑CAATGTGGCTGAATGCAGGA‑3’， BRV下游引物： 5 ’ ‑GCGGTAGTCAACACTCTTCG‑3’， BRV探针： 5 ’ ‑HEX‑TGCGCTATCA ACGCACCAGCT‑BHQ1‑3’。 2.如权利要求1中所述的一种用于 同时检测BCoV和BRV的试剂盒， 其特征在于， 所述试 剂盒中包括： (1)如权利要求1中所述的两套引物和探针； (2)2 ×ddPCR SuperMix   forProbes； (3)RNase ‑Free ddH2O； (4)待检测样品的cDNA； (5)微滴生成油； (6)微滴发生 卡； (7)微 滴发生卡密封胶垫； (8)96孔PCR反应板； (9)热封箔膜。 3.如权利要求1所述的一种同时检测BCoV和BRV的试剂盒的使用方法， 其特征在于， 包 括以下步骤： (1)、 提取待检样品的总RNA， 反转录为cDNA； (2)、 配置d dPCR反应 体系， 并加入待检样品的cDNA； (3)、 微滴的生成； (4)、 微滴PCR扩增反应； (5)、 反应结束后， 机器读取荧光信号， 自动计算目的基因含量； 样品检测结果≥ 1copies/ μL判断为阳性， 样品检测结果＜1copies/ μL判断为阴性。 4.如权利要求3所述的一种同时检测BCoV和BRV的试剂盒的使用方法， 其特征在于， 所 述双重ddPCR反应总体系为20 μL， 其中包括： (1)2 ×ddPCR SuperMix  forProbes  10 μL； (2) 两套上、 下游引物分别加450nM； (3)两种探针分别加250nM； (4)待检cDNA模板2μL； (5) RNase‑Free ddH2O补足至20 μL。 5.如权利要求3所述的一种同时检测BCoV和BRV的试剂盒的使用方法， 其特征在于， 所 述微滴PCR扩增反应条件为： 95℃预变性10min； 94℃变性30s， 58℃退火1min， 40个循环； 98 ℃10min； 4℃终止反应， 升降温速率2℃/s。 6.如权利 要求1至权利要求5中任意一项所述的一种同时检测BCoV和BRV的试剂盒在同 时检测BCoV和BRV中的应用。 7.如权利 要求1至权利要求5中任意一项所述的一种同时检测BCoV和BRV试剂盒的使用 方法在同时检测BCoV和BRV中的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114774583 A 2一种同时检测BCoV和BRV的试剂盒及其应用 技术领域 [0001]本发明属于生物技术领域， 具体涉及病毒检测试剂盒的技术领域， 更具体的涉及 一种同时检测牛 冠状病毒和牛轮 状病毒的试剂盒与应用的技 术领域。 技术背景 [0002]牛冠状病毒， BCoV属于冠状毒 科(Coronaviridae)冠状病毒属(Coronavirus)的一 种多形性、 有囊膜、 单股 正链的RNA病毒。 1972年美国的Mebus等在犊牛和成年牛的腹泻病料 中检出BCoV， 我国也于1995年 成功分离获得一株牛冠状病毒， 该病呈世界性分布。 BCoV也可 感染隐窝肠细胞， 使小肠和结肠隐窝的绒毛萎缩， 固有层坏死， 可引起 1周至3个月龄的新生 牛犊出现水样腹泻。 BCoV主要的感染途径是粪口感染和呼吸道气溶胶感染， 携带病原体的 动物从上呼吸道粘膜分泌物和消化道的排泄物中排毒， 造成同群其它动物感染发病。 感染 牛可持续带毒并排毒， 导 致牛群持续发病。 [0003]牛轮状病毒(Bovine  rotavirus， BRV)属于呼肠孤病毒 科轮状病毒属的双股RNA病 毒。 1969年Mebus最早在犊牛中发现轮状病毒， 之后澳大利亚科学家也发现了同类病毒。 1980年福建畜牧兽医研究所首次在我国发现BRV的存在， 随后在各地牛群中陆续分离出不 同株型的BRV。 该病毒可引起1～7日龄犊牛精神沉郁、 酸中毒， 并会出现食欲废绝及水样腹 泻等临床症状。 该病 可通过粪 ‑口途径传播， 主要感染空肠和回肠成熟的绒毛上皮细胞。 该 病毒具有株型众多、 易发重排、 宿主广泛、 传播迅速等生物学特性， 加之该病致死率最高达 50％， 尚无高效疫苗和特效药物， 使得牛养殖业遭受了巨大的经济损失。 另外， 已证实轮状 病毒可在人 畜间交叉传播， 也对人类公共卫 生安全存在潜在威胁 发明内容 [0004]针对目前致犊牛腹泻的主要病毒危害养牛业和现有检测方法不足的问题。 本发明 旨在提供一种具有灵敏度高、 特异性好、 准确度和精确度高， 可实现精确定量， 能够同时检 测出BCoV和BRV的检测试剂盒。 通过应用该试剂盒能够实现便利、 快速、 高效、 灵敏、 痕量、 特 异、 绝对定量的对BCoV和BRV进行检测的方法， 该试剂盒为后续对这两种病毒的预防、 早期 诊断、 及时防控和净化具有重要意 义。 [0005]为了实现本发明的目的,本发明的技 术方案如下： [0006]本申请提供一种同时检测BCoV和BRV的试剂盒， 所述试剂盒中含有特异性引物和 探针组合， 包括以下2对特异性引物和2条 特异探针， 其核苷酸序列分别为： [0007]BCOV上游引物： 5 ’ ‑GATCTACT TCACGCGCATC C‑3’， [0008]BCOV下游引物： 5 ’ ‑GTGGCTTAGTGGCATCCTTG‑3’， [0009]BCOV探针： 5 ’ ‑FAM‑TGGCTCTACTGCGCGATC CTGCA‑BHQ1‑3’； [0010]BRV上游引物： 5 ’ ‑CAATGTGGCTGAATGCAGGA‑3’， [0011]BRV下游引物： 5 ’ ‑GCGGTAGTCAACACTCTTCG‑3’， [0012]BRV探针： 5 ’ ‑HEX‑TGCGCTATCA ACGCACCAGCT‑BHQ1‑3’。说　明　书 1/8 页 3 CN 114774583 A 3