(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210264083.X (22)申请日 2022.03.17 (71)申请人 浙江大学 地址 310013 浙江省杭州市西湖区余杭塘 路866号 申请人 浙江大学滨江研究院 (72)发明人 李伟　舒强　尚世强　李伟伟　 项文清　郭雅君　陶然　史建蓉　 彭朝阳　 (74)专利代理 机构 杭州奇炬知识产权代理事务 所(特殊普通 合伙) 33393 专利代理师 贺心韬 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/686(2018.01)C12N 15/11(2006.01) C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 应用多重探针熔解曲线法检测脑炎病毒核 酸试剂盒及方法 (57)摘要 本发明提供了应用多重探针熔解曲线法检 测脑炎病毒核酸试剂盒及方法， 包括荧光PCR反 应液、 酶混合液、 阳性对照品、 阴性对照品， 所述 荧光PCR反应 液中含有PCR缓冲液、 Mgcl2、 dNTPs、 六种脑炎病毒对应的上游引物、 六种脑炎病毒对 应的下游引物、 六种脑炎病毒对应的荧光探针， 所述六种脑炎病毒分别为肠道病毒、 单纯疱疹病 毒I型、 单纯疱疹病毒II型、 人巨细胞病毒、 EB病 毒、 水痘带状疱疹病毒； 所述上游引物的序列如 SEQ ID NO:1、 SEQ  ID NO:4、 SEQ  ID NO:7、 SEQ   ID NO:10、 SE Q ID NO:13、 SE Q ID NO:16所示； 所 述下游引物的序列如SEQ  ID NO:2、 SEQ  ID NO: 5、 SEQ ID NO:8、 SEQ  ID NO:11、 SEQ  ID NO:14、 SEQ ID NO:17所示； 所述荧光探针的序列如SEQ   ID NO:3、 SEQ  ID NO:6、 SEQ  ID NO:9、 SEQ  ID  NO:12、 SEQ  ID NO:15、 SEQ  ID NO:18所示。 权利要求书2页 说明书8页 序列表5页 附图6页 CN 114752704 A 2022.07.15 CN 114752704 A 1.一种应用多重探针熔解曲线法检测脑炎病 毒核酸试剂盒， 其特征在于， 包括荧光PCR 反应液、 酶混合液、 阳性对照品、 阴性对照品， 所述荧光PCR反应液中含有PCR缓冲液、 Mgcl2、 dNTPs、 六种脑炎病毒对应的上游引物、 六种脑炎病毒对应的下游引物、 六种脑炎病毒对应 的荧光探针， 所述六种脑炎病毒分别为肠道病毒、 单纯疱疹病毒I型、 单纯疱疹病毒II型、 人 巨细胞病毒、 EB病毒、 水 痘带状疱疹病毒； 所述上游引物的序列如SEQ  ID NO:1、 SEQ  ID NO:4、 SEQ  ID NO:7、 SEQ  ID NO:10、 SEQ   ID NO:13、 SEQ  ID NO:16所示； 所述下游引物的序列如SEQ  ID NO:2、 SEQ  ID NO:5、 SEQ  ID NO:8、 SEQ  ID NO:11、 SEQ   ID NO:14、 SEQ  ID NO:17所示； 所述荧光探针的序列如SEQ  ID NO:3、 SEQ  ID NO:6、 SEQ  ID NO:9、 SEQ  ID NO:12、 SEQ   ID NO:15、 SEQ  ID NO:18所示。 2.根据权利要求1所述的一种应用多重探针熔解曲线法检测脑炎病毒核酸试剂盒， 其 特征在于， 还包括 盒体(06)， 所述盒体(06)设置有多个容器孔， 多个所述容器孔用于分别放 置荧光PCR反应液 管、 酶混合液 管、 阳性对照品管、 阴性对照品管。 3.根据权利要求1所述的一种应用多重探针熔解曲线法检测脑炎病毒核酸试剂盒， 其 特征在于， 所述阳性对照品为采用TE缓冲液溶解后得到的六种脑炎病毒扩增序列混合溶 液， 所述阳性对照品中六种脑炎病毒的扩增序列如SEQ  ID NO:19‑SEQ ID NO:24所示。 4.根据权利要求1所述的一种应用多重探针熔解曲线法检测脑炎病毒核酸试剂盒， 其 特征在于， 所述阴性对照品为无菌注射用水。 5.根据权利要求1所述的一种应用多重探针熔解曲线法检测脑炎病毒核酸试剂盒， 其 特征在于， 所述酶混合液中含有M ‑MLV逆转录酶和Taq  DNA聚合酶。 6.一种采用如权利要求1 ‑5任意一项所述的一种应用多重探针熔解曲线法检测脑炎病 毒核酸试剂盒检测脑炎病毒 核酸的方法， 其特 征在于， 包括如下步骤： 步骤S01， 核酸 提取： 利用磁珠法或柱式提取法提取待检样本的核酸； 步骤S02， 试剂配制： 取反应液和酶混合液， 配制PCR定量反应液体； 步骤S03， 扩增检测： 取步骤S01中得到的提取产物、 阳性对照品、 阴性对照品， 分别加入 上述步骤S 02得到的PCR定量反应液体， 配制PCR体系， 在4色以上的荧光定量PCR仪上进 行检 测； 步骤S04， 进行荧 光定量结果分析。 7.根据权利要求6所述的一种检测脑炎病毒核酸的方法， 其特征在于， 所述步骤S04中， 荧光定量结果分析如下： FAM探针、 VIC 探针、 ROX探针的CT值均等于45， 则为阴性标本； 当FAM探针的CT值≤43， 则判定为 通用型肠道病毒阳性； 当VIC探针的CT值≤43， 则提示为单纯疱疹病毒I型或单纯疱疹病毒II型阳性， 再分析 熔解曲线， 68.0 ±1℃产生熔解峰判定为单纯疱疹病毒I型阳性， 73.0 ±1℃产生熔解峰判定 为单纯疱疹病毒I I型阳性； 当ROX探针的CT值≤43， 则提示为水痘带状疱疹病毒、 EB病毒或人巨细胞病毒阳性， 再 分析分析熔解曲线， 66.0 ±1℃产生熔解峰判定为水痘带状疱疹病毒阳性， 71.0 ±1℃产生 熔解峰判定为EB病毒阳性， 7 7.0±1℃产生熔解峰判定为人巨细胞病毒阳性；权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114752704 A 2当CT值在43和45之间的， 重做之后CT值大于43的为阴性。 8.根据权利要求6所述的一种检测脑炎病毒核酸的方法， 其特征在于， 所述步骤S02中， 取15 μL反应液和5 μL酶混合液， 配制 20 μL PCR定性反应液体； 所述步骤S03中， 取步骤S01中 得到的提取产物、 阳性对照品、 阴性对照品均为10μL， 分别加入上述步骤S02得到的20μL   PCR定性反应液体， 配制PCR体系共3 0 μL。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114752704 A 3