(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210266085.2 (22)申请日 2022.03.17 (71)申请人 广州市微 生物研究所有限公司 地址 510663 广东省广州市黄埔区尖塔山 路1号 申请人 广东省华 微检测股份有限公司 (72)发明人 蒋丽婷　杨础华　赵培静　孙崇臻　 李小凤　黄东浪　刘蔓蔓　林秋霞　 甘祥武　文晓欣　 (74)专利代理 机构 广州市诺 丰知识产权代理事 务所(普通 合伙) 44714 专利代理师 许飞 (51)Int.Cl. C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/6844(2018.01)C12N 15/11(2006.01) C12R 1/63(2006.01) (54)发明名称 检测溶藻弧菌的RPA-IAC引物、 试剂盒、 应用 及其方法 (57)摘要 本发明公开了检测溶藻弧菌的RPA ‑IAC引 物、 试剂盒、 应用及其方法， RPA引 物对如SEQ  ID  NO.1和2所示。 本发明的RPA引物对， 对溶藻弧菌 具有良好的扩增效率、 扩增特异性， 可以提高RPA 检测的灵敏度； 不需要特殊的热循环设备、 反应 时间短， 与LA MP相比， 扩增产物没有弥散 带， RPA‑ IAC扩增产物根据引物设计位点具有特定 大小的 条带， 其结果易于判断。 通过添加扩增内标， 有效 避免了假阴性结果。 权利要求书1页 说明书10页 序列表1页 附图3页 CN 114507745 A 2022.05.17 CN 114507745 A 1.检测溶藻弧菌的RPA引物对及扩增内标组合， 其特征在于： 所述RPA引物对的核苷酸 序列为： collagenaseco llagenase‑F： 5′ ‑  GCTTATCGAGTCGATGCGC CTGACAAGTGATC  ‑3′； collagenaseco llagenase‑R： 5′ ‑  TCATAAGGGTCCCGTATGCGTACT TGCTAT  ‑3′； 所 述 所 述 扩 增内 标的 5 ′端 为 c o l l a g e n a s e c o l l a g e n a s e ‑F ， 3′为 collagenaseco llagenase‑R的反向互补序列， 中间为异种保守基因的至少部分连续序列。 2.根据权利要求1所述的RPA引物对及扩增内标组合， 其特征在于： 所述异种保守基因 的至少部分连续序列长度为25 0～320 bp。 3.根据权利要求2所述的RPA引物对及扩增内标组合， 其特征在于： 所述异种保守基因 的至少部分连续序列的核苷酸序列为gttcgagaccttcaacaccccagccatgtacgtggccatccagg cggtgctgtccctgtacgcctctggccgcaccactggcatcgtgatggactccggagacggggtcacccacacggt gcccatctacgaggggtacgccctgccccacgccatcctgcgtctggacctggctggccgggacctgaccgactac ctcatgaagatcctgacggagcggggctacagcttcaccaccacggccgagcgggagatcgtgcg ggacatcaagg。 4.根据权利要求1～3任一项所述的RPA引物对及扩增内标组合， 其特征在于： 所述扩增 内标插入在质粒内。 5.一种检测溶藻弧菌的试剂盒， 其特征在于： 其包括权利要求1～4任一项所述的RPA引 物对及扩增内标组合。 6.根据权利要求5所述的试剂盒， 其特 征在于： 还 包括以下组分中的至少一种： RPA恒温扩增试剂； DNA提取试剂； 阳性对照和阴性对照。 7.权利要求1～4任一项所述的引物对及扩增内标组合在制备溶藻弧菌检测试剂中的 应用。 8.一种检测溶藻弧菌的RPA ‑IAC方法， 其特 征在于： S1)获得待测样本的DNA或RNA； S2)使用权利要求1～4任一项所述的引物对及扩增内标组合， 进行RPA ‑IAC扩增； S3)基于RPA ‑IAC扩增结果， 确定样本中是否存在溶藻弧菌 。 9.根据权利要求8所述的RPA ‑IAC方法， 其特 征在于： 所述待测样本为贝类水产品。 10.根据权利要求8或9所述的RPA ‑IAC方法， 其特 征在于： RPA ‑IAC扩增反应的体系为： 含有冻干酶粉的0.2  mL  TwistAmp 反应管 再水化缓冲液         29.5 μL RPA引物对            终浓度均为0.4  μmol/L 含有扩增内标的质粒   1.83×103 copies 模板DNA           50 ng 醋酸镁溶 液           2.5 μL， 浓度为280  mmol/L 去离子水             补足至50 μL； 和/或 RPA‑IAC扩增反应的反应条件为37℃反应40  min。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114507745 A 2检测溶藻 弧菌的RPA‑IAC引物、 试剂盒、 应用及其方 法 技术领域 [0001]本发明涉及生物检测领域， 特别涉及检测贝类水产品中溶藻弧菌 的方法、 引 物及 试剂盒。 背景技术 [0002]溶藻弧菌是一种无荚膜的革兰氏阴性嗜盐弧菌， 在海水养殖的牡蛎、 虾和蟹等贝 类、 甲壳类水生动物中分布广泛， 是流行程度、 危害程度最高的食 源性致病菌之一。 [0003]目前世界上大部分沿海国家都有溶藻弧菌 的致病报道， 我国江浙、 闽粤沿海亦有 较多的感染报道， 更有 数例因溶藻弧菌感染的案例， 是公众饮食健康的重大威胁之一， 所以 对溶藻弧菌的检测在公共卫 生上具有十分重要的意 义。 [0004]目前， 对溶藻弧菌的检测仍主要依靠传统方法， 即首先利用选择性培养基增菌， 进 而结合生化及血清学方法进行鉴定。 传统方法检测结果准确， 但是存在检测效率低、 检测目 标单一、 灵敏度低且耗时长、 操作繁琐等不足。 为满足致病菌快速检测的要求， 发展了 VIDAS‑酶联荧光免疫法(VIDAS ‑CHL)、 酶免疫法(EIA)、 聚合酶链式反应(PCR)、 胶体金试纸 条法、 API  生化鉴定试纸条法、 环介导恒温扩增(LAMP)技术和实时荧光PCR等方法。 其中， VIDAS‑ CHL法、 EIA法、 胶体金试纸法和API法均存在特异性差、 灵敏度低等缺陷， 而没有得 到广泛应用； LAMP法， 作为一种新兴 的检测方法， 尽管极大地提高了检测效率， 又降低了检 测成本， 但是产生的假阳性率较高。 PCR技术作为一种高度灵敏、 快速简便的检测方法在诸 多领域得到广泛应用， 尤其在病原体检测方面取得了革命性的成果， 成为核酸快速检测的 一个金标准， 并在此基础之上， 又发展了DNA探针技术、 实时荧光PCR技术和PCR结合变性高 效液相色谱(DHPLC)技术等， 而PCR引物的设计成为了制约该类检测方法成败的关键性因 素， 常规的PCR引物设计， 不仅需要反复比对引物的特异性， 而且需要优化引物的各项参数 与反应条件， 尤其是退火温度更是进 行反复优化， 以防止非特异 性扩增， 在这些条件的制约 下选取的引物极易影响扩增的有效性和特异性。 此外， 荧光检测设备普遍售价偏高， 也在一 定程度上限制了这类 检测方法的推广应用。 [0005]重组酶聚合 酶扩增(Recombinase  Polymerase  Amplificat ion， RPA)， 被称为是可 以替代PCR的核酸检测技术。 RPA技术主要依赖于三种酶： 能结合单链核酸(寡核苷酸引物) 的重组酶、 单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换DNA聚合 酶。 RPA可以恒温反应， 检测的灵敏度很 高， 能够将痕量的核酸(尤其是DNA)模板扩增到可以检出的水平， 从单个模板分子得到大约 1012扩增产物。 而且RP A还用不着复杂的样品处理， 适用于无法提取核酸的实地检测。 这 些特 点使得RPA越来越受到人们的欢迎 。 [0006]作为一种相对较新的扩增技术， RPA的成熟度远不及常规的PC R技术。 RPA分析的关 键在于扩增引物和探针的设计， 已有的研究表明RPA引物对于RPA检测效果的影响是极其重 要的， 针对同一物种， 不同的RPA引物具有极其显著的差异。 传统的PCR引物设计方法基本无 法应用于RPA引物的设计， 因为RPA引物比一般PCR引物长， 通常需要达到30 ‑38个碱基。 引物 过短会降低重组率， 影响扩增 速度和检测灵敏度。 在设计RPA引物时， 变性温度不再是影响说　明　书 1/10 页 3 CN 114507745 A 3