(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210269994.1 (22)申请日 2022.03.18 (71)申请人 中国水稻研究所 地址 310006 浙江省杭州市体 育场路359号 (72)发明人 樊叶杨　朱玉君　张振华　黄得润　 庄杰云　 (74)专利代理 机构 浙江杭州金通专利事务所有 限公司 3 3100 专利代理师 刘晓春 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/6858(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 水稻抗稻瘟病基因Pi25的功能特异性PCR分 子标记及其应用 (57)摘要 本发明提供了水稻抗稻瘟病基因Pi25的功 能特异性PCR分子标记及其应用， 特征在于其引 物。 利用该标记对水稻苗期所提取的DNA进行PCR 扩增和琼脂糖电泳， 可以检测待测材料是否携带 水稻抗稻瘟病等位基因Pi25， 操作简单、 安全经 济、 且准确性高、 特异性强， 可应用于水稻抗稻瘟 病基因Pi25的分子标记辅助选择育种以及水稻 种质资源筛 选鉴定。 权利要求书1页 说明书7页 序列表1页 附图2页 CN 114736981 A 2022.07.12 CN 114736981 A 1.检测水稻抗稻瘟病基因Pi25的功能特异性PCR分子标记Pi25 ‑2687， 特征在于其引 物： 外引物上游序列为5' ‑CACACCTGAATGAAATTAAGATGACA ‑3'， 如序列表SEQ  ID No:1所示； 外引物下游序列为5' ‑ATATACAATATTGAGGGTATGGAAC‑3'， 如序列表SEQ  ID NO:2所示； 内引物上游序列为5' ‑GCTTGTGGATAGAGTC CTTCG‑3'， 如序列表SEQ  ID No:3所示； 内引物下游序列为5' ‑TCACAAATCATTCGCTCTTTTAACT‑3'， 如序列表SEQ  ID NO:4所示。 2.权利要求1所述的功能特异性PCR分子标记Pi25 ‑2687检测水稻 抗稻瘟病基因Pi25基 因型的方法， 特 征在于： (1)采用待检测样本的基因组DNA为模板， 应用权利 要求1所述的功能特异性PCR分子标 记的引物进行PCR扩增； (2)采用2％琼脂糖凝胶电泳分离扩增产物； (3)根据电泳结果判定Pi25的基因型： 能够检测到469bp和318bp条带的为Pi25纯合抗 性基因型； 检测到469bp和196bp条带的为pi25 纯合感病基因型； 同时检测到469bp、 318bp和 196bp条带的为杂合基因型。 3.权利要求1所述的功能特异性PCR分子标记Pi25 ‑2687在水稻抗稻瘟病基因Pi25的分 子标记辅助选择育种和水稻种质资源的筛 选鉴定中的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114736981 A 2水稻抗稻瘟病基因Pi25的功能特异性PCR分子标记及其应用 技术领域 [0001]本发明属于农业生物技术领域， 特别涉及抗稻瘟病基因Pi25的功能特异性PCR分 子标记及其应用。 背景技术 [0002]稻瘟病是危害水稻最严重的病害之一， 种植抗稻瘟病水稻品种是解决该问题最经 济有效的手段。 优异抗 性基因的挖掘和利用是培 育抗稻瘟病水稻品种的前提条件。 [0003]Pi25是来源于我国四川籼稻品种谷梅2号中的一个广谱、 持久抗稻 瘟病基因(Chen   et al., 2011)。 鉴于Pi25基因的重大利用价值， 申请人开发了多个用于检测Pi25的分子标 记。 但随着技术的发展和需求的提高， 这些标记 也暴露出一些不 足之处。 比如： 1)SK17(专利 号： ZL 200310100888.8)、 SA7(专利号： ZL  200310100889.2)以及Si13068、 Si13070B2、 Si13070C 和Si13070D(专利号： Z L 200910155609.5)等标记均为Pi2 5基因连锁的PCR标记， 虽然操作简便， 但其准确性略低于基因标记或功能标记； 2)P25 ‑1(专利号： ZL   200910152617.4)  是基于基因编码区1个单核苷酸多态性(SNP)设计的特异性PCR标记， 但 其为显性标记， 无法区分抗性纯合和杂合基因型； 3)CAP1/Hinc  II、 CAP3/Bgl  II、 CAP3/Nde   I和CAP3/Hpy  99I 等标记(王惠梅等， 2012)是基于基因编码区多个SNPs设计的共显性特异 分子标记， 但其属于 CAPS标记， 在操作中 需要对PCR产物进行酶切， 简便性 不如PCR标记。 [0004]近几年， 基于Pi25基因编码区的SNPs， 研究者也开发了特异SNP共显性PCR分子标 记 (专利号： ZL  201610014679.9)和竞争性等位基因特异性PCR(KASP)分子标记(专利号：   202011457366.3)。 前者SNP位于ATG启动子后2566bp(以下简称为SNP2566)， 抗性等位基因 型为c， 感病等位基因型为g； 后者SNPs位于ATG启动子后775bp和2687bp(以下简称为SNP775 和SNP2687)， 抗性等位基因型均为g， 感病等位基因型均为a。 根据王惠梅等(2012)  的报道， Tetep等位基因虽然在SNP2566上具有和抗性等位基因谷梅2号相同的碱基序列c， 但是在 SNP775和SNP2687上则具有和感病等位基因中鉴100相同的碱基序列a， 并且Tetep  的全长 编码序列均比谷梅2号和中鉴100短了312bp， 表明Tetep等位基因有别于谷梅2号抗性等位 基因。 因此， 仅利用SNP2566开发的分子标记可能会导致将Tetep等位基因型误判为谷梅2号 抗性等位基因型。 而基于SNP775和SNP2687开发 的KASP标记尽管可以区分Tetep  等位基因 型和谷梅2号等位基因型， 但操作中需要在引物合成时人为添加荧光标记， 且仪器昂贵， 检 测成本明显偏高。 [0005]为精确、 简便且经济地鉴定Pi25的谷梅2号抗性等位基因， 本发明针对谷梅2号编 码区内特有的功能SNPs(SNP7 75和SNP2687)， 开发共显性PCR分子标记。 发明内容 [0006]本发明的目的是提供鉴定抗稻瘟病基因P i25的功能特异性PCR分子标记及其检测 方法。 [0007]本发明通过以下技 术方案实现：说　明　书 1/7 页 3 CN 114736981 A 3