(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210266576.7 (22)申请日 2022.03.18 (71)申请人 达州职业 技术学院 地址 635099 四川省达州市通川区北外徐 家坝路448号 (72)发明人 王勤　欧云文　刘俐君　 (74)专利代理 机构 北京兴智翔达知识产权代理 有限公司 1 1768 专利代理师 郭卫芹 (51)Int.Cl. C12N 15/11(2006.01) C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/686(2018.01) (54)发明名称 PCV-2、 PCV-3、 PCV-4三重PCR鉴别检测 方法 的建立和应用 (57)摘要 本发明公开了一种用于PCV ‑2、 PCV‑3、 PCV‑4 三重PCR鉴别检测的引物、 方法和在制备三重PCR 鉴别检测试剂盒的应用， PCV ‑2的引物为P1： TGTTTTCGAAGGCA， P2： ACAGCCCTAACCTATG； PCV ‑3 的引物为P3： GAGCGCTCGTAGTTCC， P4： AGAAGGCGCTATGTC； PCV ‑4的引物为P5： TGTTTGGGGTAGTTA， P6： CAATCAGATCTAGG。 反应体 系为： 2×Taq MasterMix  25.0μL、 引物各0.5μ L、 模板3.0μL、 H2O 19.0μL； 反应程序为： 95℃ 5min； 95℃40s， 50℃40s， 72℃40s， 30个循环； 72 ℃10min。 建立的PCV ‑2、 PCV‑3、 PCV‑4三重PCR鉴 别检测方法具有良好的特异性、 敏感性、 准确性 和临床适用性， 为PCV ‑2、 PCV‑3、 PCV‑4的临床鉴 别诊断提供一种简便、 快速的分子生物学检测技 术。 权利要求书1页 说明书5页 序列表2页 附图2页 CN 114480379 A 2022.05.13 CN 114480379 A 1.一种用于PCV ‑2、 PCV‑3、 PCV‑4三重PCR鉴别检测的引物， 其特 征在于， PCV‑2的引物为P1： ACTGT TTTCGAAGGCA， P2： ACAGC CCTAACCTATG； PCV‑3的引物为P3： GAGCGCTCGTAGT TCC， P4： AGA AGGCGCTATGTC； PCV‑4的引物为P5： TGT TTGGGGTAGTTA， P6： GC CAATCAGATCTAG G。 2.一种PCV‑2、 PCV‑3、 PCV‑4三重PCR鉴别检测的方法， 其特征在于， 反应体系为： 2 ×Taq  MasterMix  25.0μL、 引物各0.5μL、 模板3.0μL、 H2O 19.0μL； 反应程序为： 95℃5min； 95℃ 40s， 50℃40s， 72℃40s， 3 0个循环； 72℃10mi n。 3.一种PCV ‑2、 PCV‑3、 PCV‑4三重PCR鉴别检测的试剂盒， 其特征在于， 包括权利要求1所 述的引物。 4.根据权利要求2所述 的试剂盒， 其特征在于， 反应体系为： 2 ×Taq MasterMix  25.0μ L、 引物各0.5μL、 模板3.0μL、 H2O 19.0μL； 反应程序为： 95℃5min； 95℃40s， 50℃40s， 72℃ 40s， 30个循环； 72℃10mi n。 5.一种PCV ‑2、 PCV‑3、 PCV‑4三重PCR鉴别检测的建立方法： 其特 征在于， 包括以下步骤： 一、 单项PCR扩增及重组质粒 标准品的制备 分别利用引物P1/P2、 P3/P4、 P5/P6， 对PCV ‑2、 PCV‑3、 PCV‑4进行单项PCR扩增， 反应体系 为： 2×Taq MasterMix  25.0 μL、 上下游引物各0.5 μL、 核酸5.0 μL、 H2O 19.0 μL； 反应程序为： 95℃5min； 9 5℃40s， 50℃40s， 72℃40s， 30个循环； 72℃10min； PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电 泳检测后， 克隆至pMD19 ‑T载体， 分别构建pMD19 ‑PCV2、 pMD19 ‑PCV3、 pMD19 ‑PCV4重组质粒， 重组质粒测序鉴定正确后， 超微 量蛋白核酸分析仪测定质粒浓度， 并计算拷贝数； 二、 三重PCR反应条件的优化 以重组质粒pMD19 ‑PCV2、 pMD19‑PCV3、 pMD19 ‑PCV4的等 量混合物 (pMD19‑PCV2/pMD19 ‑PCV3/pMD19 ‑PCV4)为模板， 以引物P1/P2、 P3/P4、 P5/P6的等量混 合物为扩增引物， 采用统计学方法依次对模板含量、 引物含量、 退火温度进行摸索和优化， 确定三重PCR的反应条件。 6.根据权利要求5所述的建立方法： 其特征在于， 引 物P1/P2对PCV ‑2扩增出216bp的特 异性条带， 而对PCV ‑3、 PCV‑4无扩增条带； 引物P3/P4对PCV ‑3扩增出415bp的特异性条带， 而 对PCV‑2、 PCV‑4无扩增条带； 引物P5/P6对PCV ‑4扩增出大小为678bp的特异性条带， 而对 PCV‑2、 PCV‑3无扩增条带； 重组质粒pMD19 ‑PCV2、 pMD19 ‑PCV3、 pMD19‑PCV4的拷贝数分别1.6 ×1011、 6.2×1010、 5.4×1010拷贝/ μL， 将三种质粒的拷贝数均适当稀释成1.0 ×1010拷贝/ μ L， 等体积混合。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114480379 A 2PCV‑2、 PCV‑3、 PCV‑4三重PCR鉴别检测方 法的建立和应用 技术领域 [0001]本发明涉及一种分子生物学检测技术， PCV ‑2、 PCV‑3、 PCV‑4三重PCR鉴别检测方 法、 试剂盒和应用。 背景技术 [0002]猪圆环病毒(porcine  circovirus， P CV)为无囊膜、 单股、 负链、 环状DNA病毒， 是迄 今为止能够感染哺乳动物的最小病毒， 目前具有PCV ‑1、 PCV‑2、 PCV‑3、 PCV‑4四种基因型。 其 中PCV‑1于1974年被首次报道， 其对猪无致病性； PCV ‑2于1998年被首次报道， 其是引发断奶 仔猪多系统衰竭、 猪皮炎肾病、 猪呼吸道疾病、 猪繁殖障碍等相关疾病的病原体； PCV ‑3于 2016年被首次报道， 其与猪 皮炎肾病、 猪繁殖障碍、 多系统炎症 等疾病有关； PCV ‑4于2019年 在我国湖南被首次发现， 其具有典型的PCV基因组结构， 与PCV ‑1、 PCV‑2、 PCV‑3基因组相似 性为43.2％ ‑51.5％。 鉴于PCV ‑2、 PCV‑3、 PCV‑4引起临床特征的高度相似性， 加强PCV ‑2、 PCV‑3、 PCV‑4的实验室鉴别诊断对猪圆环病毒病的综合防控至关重要。 目前， 已有分别针对 PCV‑2与PCV‑3、 PCV‑2与PCV‑4、 PCV‑3与PCV‑4的双重PCR鉴别检测方法， 但迄今尚未有同时 鉴别检测3种基因型的多重PCR检测方法。 发明内容 [0003]为解决上述技术问题， 本发明提供一种用于PCV ‑2、 PCV‑3、 PCV‑4三重PCR鉴别检测 的引物， [0004]PCV‑2的引物为P1： ACTGT TTTCGAAGGCA， P2： ACAGC CCTAACCTATG； [0005]PCV‑3的引物为P3： GAGCGCTCGTAGT TCC， P4： AGA AGGCGCTATGTC； [0006]PCV‑4的引物为P5： TGT TTGGGGTAGTTA， P6： GC CAATCAGATCTAG G。 [0007]一种PCV ‑2、 PCV‑3、 PCV‑4三重PCR鉴别检测的方法， 反应体系为： 2 ×Taq  MasterMix  25.0μL、 引物各0.5μL、 模板3.0μL、 H2O 19.0μL； 反应程序为： 95℃5min； 95℃ 40s， 50℃40s， 72℃40s， 3 0个循环； 72℃10mi n。 [0008]一种PCV‑2、 PCV‑3、 PCV‑4三重PCR鉴别检测的试剂盒， 包括上述的引物。 [0009]优选地， 反应体系为： 2 ×Taq MasterMix  25.0μL、 引物各0.5μL、 模板3.0μL、 H2O  19.0 μL； 反应程序为： 95℃5mi n； 95℃40s， 5 0℃40s， 72℃40s， 3 0个循环； 72℃10mi n。 [0010]一种PCV‑2、 PCV‑3、 PCV‑4三重PCR鉴别检测的建立方法： 包括以下步骤： [0011]一、 单项PCR扩增及重组质粒 标准品的制备 [0012]分别利用引物P1/P2、 P 3/P4、 P5/P6， 对P CV‑2、 PCV‑3、 PCV‑4进行单项P CR扩增， 反应 体系为： 2 ×Taq MasterMix  25.0 μL、 上下游引物各0.5 μL、 核酸5.0 μL、 H2O 19.0 μL； 反应程 序为： 95℃5min； 95℃40s， 50℃40s， 72℃40s， 30个循环； 72℃10min； PCR扩增产物经琼脂糖 凝胶电泳检测后， 克隆至pMD19 ‑T载体， 分别构建pMD19 ‑PCV2、 pMD19 ‑PCV3、 pMD19‑PCV4重组 质粒， 重组质粒测序鉴定