(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210275046.9 (22)申请日 2022.03.21 (71)申请人 深圳金域医学检验实验室 地址 518129 广东省深圳市龙岗区坂田街 道岗头社区雪岗北路2045号 申请人 广州市金域 转化医学研究院有限公 司 (72)发明人 黄晓强　沈建如　陈遥　凌宝　 贺亮　程雅婷　于世辉　马骥　 (74)专利代理 机构 广州新诺专利商标事务所有 限公司 4 4100 专利代理师 李海恬 (51)Int.Cl. C12Q 1/6806(2018.01) C40B 50/06(2006.01)C12Q 1/6883(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12Q 1/6837(2018.01) (54)发明名称 基于不对称扩增的文库构建引物组及其应 用 (57)摘要 本发明涉及一种基于不对称扩增的文库构 建引物组及其应用， 属于基因检测技术领域。 该 文库构建引物组包括： 接头序列、 由若干种基因 特异性引物组成的引物池、 通用扩增引物， 所述 接头序列依次由配对茎结构序列、 单分子标签序 列、 第一样本标签序列和芯片固定序列组成， 所 述基因特异性引物由特异性互补引物、 测序引物 和第二样 本标签序列组成。 本发 明的文库 构建引 物组及采用该文库进行的基因检测， 既具有基于 多重PCR的二代测序 捕获率高， 覆盖率高的优点， 又能利用UMI进行数据校正， 特别适用于微小残 留病等靶标含量低、 精度要求高的检测中。 权利要求书2页 说明书9页 序列表64页 附图1页 CN 114592035 A 2022.06.07 CN 114592035 A 1.一种基于不对称扩增的文库构建引物组， 其特征在于， 包括： 接头序列、 由若干种基 因特异性引物组成的引物池、 通用扩增引物， 所述接头序列依次由配对茎结构序列、 单分子 标签序列、 第一样本标签序列和芯片 固定序列 组成， 所述基因特异性引物由特异性互补引 物、 测序引物和第二样本标签序列组成。 2.根据权利要求1所述的基于不对称扩增的文库构建引物 组， 其特征在于， 所述配对茎 结构序列为12 ±4bp互补配对的碱基对， 所述单分子标签为12 ±4nt的随机碱基， 所述第一 样本标签序列为8 ±2nt的index1， 所述第二样本标签序列为8 ±2nt的index2。 3.根据权利要求1所述的基于不对称扩增的文库构建引物 组， 其特征在于， 所述芯片固 定序列为20nt的P5序列。 4.根据权利要求1所述的基于不对称扩增的文库构建引物 组， 其特征在于， 所述基因特 异性引物A的浓度为0.04 ‑0.00004 μM， 所述通用扩增引物B的浓度为0.05 ‑1μM， 且所述基因 特异性引物的浓度总和与所述通用扩增引物的摩尔浓度比k>38， 同时k>n ‑4， n为基因特异 性引物A的种类数。 5.根据权利要求1 ‑3任一项所述的基于不对称扩增的文库构建引物 组， 其特征在于， 所 述浓度比k 通过以下 方法得到： 建立数学模型a+b＝2(aa+ab)+a ’+b’， 其中， a为基因特异性引物A的浓度， b为通用扩增 引物B的浓度b， a ’为体系中剩 余基因特异性引物A的浓度， b ’为体系中剩 余通用扩增引物B 的浓度； 则a ’＝a‑(2aa+ab)， b’＝b‑ab； 由于产生AA的概率 aa， 产生AB的概率为 ab； 在ab最大同时aa较小的情况下， 以概率模型 求得最优的a与b， k ＝b/a； 其中根据目的区域设计的特异性引物A包括n种特异性引物， a为各特异性引物A的浓 度。 6.根据权利要求1 ‑3任一项所述的基于不对称扩增的文库构建引物 组， 其特征在于， 所 述特异性互补引 物长度为22 ‑26nt， GC含量为45 ‑55％， Tm为60 ‑70℃， 且Tm ‑L–Tm‑X≥0； 其 中， Tm‑L为特异性互补引物的熔解温度， Tm ‑X为通用扩增引物的熔解温度。 7.根据权利要求1所述的基于不对称扩增的文库构建引物 组， 其特征在于， 所述配合引 物序列如SEQ  ID NO.1所示， 所述特异性互补引物选自SEQ  ID NO.2‑412所示序列。 8.一种基于不对称扩增的文库构建方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： 引物设计： 获取目标扩增基因参考序列作为引物设计模板， 将模板序列分割为DNA片 段， 设计每段DNA片段的上 下游引物， 使所 得扩增产物片段比所述DNA片段短20 ‑50bp； 构建引物池： 合成上述设计得到的引物， 并在其一端添加测序引物和第二标本标签序 列； 制备接头序列： 制备权利要求1 ‑7任一项所述的接 头序列， 备用； 文库构建： 取待测样本， 提取核酸并加上所述接头序列， 纯化去除多余接头， 加入权利 要求1‑7任一项所述的基因特异性引物和通用扩增引物， 进行PCR扩增富集靶标区域， 纯化 产物， 采用通用引物与携带测序引物和第二样本标签序列配对的引物扩增靶标文库， 即得 所述基于不对称扩增的文库。 9.根据权利要求8所述的文库构建方法， 其特征在于， 所述引物设计步骤中， 将所述引 物设计模板分割为245bp长的DNA片段， 并使相邻的DNA片段之间有约100bp的重叠 区域； 设权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114592035 A 2计得到的特异性互补引物长度为22 ‑26nt， GC含量为45 ‑55％， Tm为60 ‑70℃， 且Tm ‑L–Tm‑X≥ 0； 其中， Tm ‑L为特异性互补引物的熔解温度， Tm ‑X为通用扩增引物的熔解温度。 10.根据权利要求9所述的文库构建方法， 其特征在于， 所述引物设计步骤中， 根据引物 之间的距离调整引物， 使2条相邻的特异性互补引物之间的距离不小于100bp， 且不大于 225bp。 11.权利要求8 ‑9任一项所述的方法构建得到的基于不对称扩增的文库。 12.一种基于不对称扩增的基因检测系统， 其特 征在于， 包括： 检测模块， 将权利要求1 1所述的文库上机检测， 获得测序数据； 分析模块， 利用所述单分子标签序列信 息， 对获得的测序数据进行矫正， 即得待测 样本 测序结果。 13.根据权利要求12所述的基于不对称扩增的基因检测系统， 其特征在于， 所述待测样 本为用于微小残留病监测的外周血样本 。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114592035 A 3