(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210281689.4 (22)申请日 2022.03.21 (71)申请人 广州尔立简生物科技有限公司 地址 510010 广东省广州市天河区广州大 道北520号自编10 5房自编D13 5号 (72)发明人 陈斌　钟玙沄　 (74)专利代理 机构 广州市越秀区哲力专利商标 事务所(普通 合伙) 44288 专利代理师 骆志豪 (51)Int.Cl. C12Q 1/6886(2018.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 用于粪便脱落细胞DNA甲基化检测的生物靶 点、 引物探 针组合物和应用和试剂盒及其用法 (57)摘要 用于粪便脱落细胞DNA甲基化检测的生物靶 点、 引物探针组合物和应用和试剂盒及其用法， 涉及体外检测技术领域； 生物靶点在粪便脱落细 胞DNA甲基化检测的生物靶点的应用， 所述生物 靶点包括SFRP2、 NPY、 PDX1、 APC、 COL4A2、 FGF5和 SDC2基因。 本发明的引物探针组合物， 其可实现 SFRP2、 NPY、 PDX1、 APC、 COL4A2、 FGF5和SDC2基因 的甲基化特异性扩增检测， 上述基因组合的甲基 化情况可用作大肠癌恶性程度和预后评价的分 子生物学标记， 实现大肠癌的筛查， 准确性高。 权利要求书2页 说明书13页 序列表4页 附图5页 CN 114959024 A 2022.08.30 CN 114959024 A 1.一种用于粪便脱落细胞DNA甲基化检测的生物靶点， 其特征在于， 所述生物靶点包括 SFRP2、 NPY、 P DX1、 APC、 COL 4A2、 FGF5和S DC2基因。 2.一种用于粪便脱落细胞DNA甲基化检测的引物探针组合物， 其特征在于， 具体包括： 用于SFRP2基因甲基化特异性扩增的第一正 向引物、 第一探针和第一反向引物； 用于NPY基 因甲基化特异性扩增的第二正向引物、 第二探针和第二反向引物； 用于PDX1基因甲基化特 异性扩增的第三正向引物、 第三探针和 第三反向引物； 用于AP C基因甲基化特异 性扩增的第 四正向引物、 第四探针和第四反向引物； 用于COL4A2基因甲基化特异性扩增的第五正向引 物、 第五探针和 第五反向引物； 用于FGF5基因甲基化特异 性扩增的第六正向引物、 第六探针 和第六反向引物； 用于SDC2基因甲基化特异性扩增的第七正向引物、 第七探针和第七反向 引物； 所述第一 正向引物的核苷酸序列如SEQ  ID NO:1所示； 所述第一探针的核苷酸序列如SEQ  ID NO:2所示； 所述第一反向引物的核苷酸序列如SEQ  ID NO:3所示； 所述第二 正向引物的核苷酸序列如SEQ  ID NO:4所示； 所述第二探针的核苷酸序列如SEQ  ID NO:5所示； 所述第二反向引物的核苷酸序列如SEQ  ID NO:6所示； 所述第三 正向引物的核苷酸序列如SEQ  ID NO:7所示； 所述第三探针的核苷酸序列如SEQ  ID NO:8所示； 所述第三反向引物的核苷酸序列如SEQ  ID NO:9所示； 所述第四正向引物的核苷酸序列如SEQ  ID NO:10所示； 所述第四探针的核苷酸序列如SEQ  ID NO:11所示； 所述第四反向引物的核苷酸序列如SEQ  ID NO:12所示； 所述第五正向引物的核苷酸序列如SEQ  ID NO:13所示； 所述第五探针的核苷酸序列如SEQ  ID NO:14所示； 所述第五反向引物的核苷酸序列如SEQ  ID NO:15所示； 所述第六正向引物的核苷酸序列如SEQ  ID NO:16所示； 所述第六探针的核苷酸序列如SEQ  ID NO:17所示； 所述第六反向引物的核苷酸序列如SEQ  ID NO:18所示； 所述第七正向引物的核苷酸序列如SEQ  ID NO:19所示； 所述第七探针的核苷酸序列如SEQ  ID NO:20所示； 所述第七反向引物的核苷酸序列如SEQ  ID NO:21所示。 3.如权利要求2所述的用于粪便脱落细胞DNA甲基化检测的引物探针组合物， 其特征在 于： 所述第一探针、 第二探针、 第三探针、 第四探针、 第五探针、 第六探针和第七探针的5 ’端 分别标记有FAM、 VIC、 ROX、 CY5和HEX荧光基团的任一种； 其3 ’端分别标记有MGB、 BHQ淬灭基 团的任一种。 4.一种权利要求2或3所述的用于粪便脱落细胞DNA甲基化检测的引物探针组合物在制 备检测大肠癌试剂中的应用。 5.一种基于粪便脱落细胞DNA甲基化状态检测大肠癌的试剂 盒， 其特征在于： 包括荧光 定量反应液， 所述荧光定量反应液包括权利要求2或3所述的用于粪便脱落细胞DNA甲基化权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114959024 A 2检测的引物探针组合物。 6.如权利要求5所述的试剂 盒， 其特征在于： 所述荧光定量反应液包括第 一荧光定量反 应液和第二 荧光定量反应液； 所述第一荧光定量反应液包括： 第一正向引物、 第一探针、 第一反向引物、 第二正向引 物、 第二探针、 第二反向引物、 第三正向引物、 第三探针、 第三反向引物、 第四正向引物、 第四 探针和第四反向引物； 所述第二荧光定量反应液包括： 第五正向引物、 第五探针、 第五反向引物、 第六正向引 物、 第六探针、 第六反向引物、 第七正向引物、 第七探针和第七反向引物。 7.如权利要求5或6所述的试剂盒， 其特征在于： 还包括裂解液、 内参基因 的引物及探针 和亚硫酸氢盐溶 液。 8.如权利 要求7所述的试剂盒， 其特征在于： 内参基因为GAPDH， 所述 内参基因的正向引 物、 探针和反向引物分别如SEQ  ID NO:22～24所示。 9.一种权利要求5 ‑8任一项所述的基于粪便脱落细胞DNA甲基化状态检测大肠癌的试 剂盒的使用方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： 1)收集粪便脱落细胞样本； 2)从所述粪便脱落细胞样本中提取基因 组DNA； 3)将所述基因组DNA进行甲基化转化， 使基因组DNA的胞嘧啶转化为尿嘧啶， 得到bis ‑ DNA； 4)将所述bis ‑DNA进行PCR扩增。 10.如权利要求9所述的基于粪便脱落细胞DNA甲基化状态检测大肠癌的试剂 盒的使用 方法， 其特征在于： 步骤4)中， PCR扩增荧光程序为： 第一步为温度93 ‑97℃， 时间4 ‑6min， 循 环1次； 第 二步为温度93 ‑97℃， 时间14 ‑16s后， 温度63 ‑65℃， 时间28 ‑32s， 循环18 ‑22次； 第 三步为温度93 ‑97℃， 时间9 ‑11s， 循环38 ‑42次后， 温度58 ‑62℃， 时间3 0‑32s， 采集 荧光。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114959024 A 3