(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210278071.2 (22)申请日 2022.03.21 (71)申请人 哈尔滨医科 大学 地址 150081 黑龙江省哈尔滨市南岗区保 健路157号 (72)发明人 宋盈　孟祥宁　蔡梦迪　肖云　 傅松滨　冯犇　王利强　关荣伟　 (74)专利代理 机构 北京棘龙知识产权代理有限 公司 11740 专利代理师 张开 (51)Int.Cl. C12N 5/071(2010.01) C12N 5/09(2010.01) C12Q 1/6869(2018.01) C12N 15/11(2006.01)C12Q 1/6886(2018.01) (54)发明名称 一种MTX耐药肿瘤细胞扩增子的进化和形成 机制分析方法 (57)摘要 本发明公开了一种MTX耐药肿瘤细胞扩增子 的进化和形成机制分析方法， 涉及生物技术领 域， 可以针对MTX耐药且DHFR基因高度扩增的恶 性肿瘤细胞， 以断裂点接头序列为切入点， 构建 置信断裂点筛选模型， 揭示扩增子的非线性进化 过程和肿瘤耐药克隆进化的全 过程， 并揭示非同 源修复机制介导扩增子的形成， 从而为去除肿瘤 细胞中DMs的形成或逆转肿瘤耐药提供关键靶 点。 权利要求书3页 说明书18页 附图10页 CN 114790440 A 2022.07.26 CN 114790440 A 1.一种MTX耐药肿瘤细胞扩增子的进化和形成机制分析方法， 其特征在于， 包括以下步 骤： S1： 首先， 将人结肠癌细胞系HT29用浓度梯度递增的MTX进行连续培养， 待每个浓度梯 度细胞对相应药物浓度耐受后， 继续培养5个月直至其稳定耐药后， 继续后续实验， HT29亲 本及耐药细胞在 含15％胎牛血清的D MEM高糖培养基中培养， 耐药细胞系培养基中添加相应 浓度的MTX， 所有细胞均培 养在5％二氧化 碳、 37℃恒温细胞培 养箱中； S2： 取数量不超过5 ×106的生长情况良好的细胞， PBS冲洗3次、 胰酶消化并用培养基制 备细胞悬液， 1000转/分离心5分钟， 弃掉上清并用PBS冲洗沉淀， 再次离心， 弃上清得到细胞 沉淀， 将细胞沉淀弹开并加入2 00 μl PBS、 20 μl蛋白酶K和200 μl  Buffer AL混匀后56℃水浴 10分钟， 随后加入200μl无水乙醇， 涡旋混匀， 将液体吸出并加入到QIAmp  mini离心柱中， 8000转/分离心1分钟后更换收集管， 向柱子中加入500 μl  Buffer AW1离心后更换 收集管， 条件同上， 再加入500 μl  Buffer AW2,14000转/分全速离心3分钟， 将柱子转移至新的1.5ml   Eppendorf管中， 加适量Buffer  AE， 室温孵育3分钟后8000转/分离心1分钟， Eppendorf管中 离心得到的液体即为基因 组DNA， 测定DNA浓度并统一配平至 50ng/ μl； S3： 联合应用DELLY、 LUMPY和CREST共同调取人结肠癌HT29亲本及18个MTX梯度耐药细 胞系全基因组测序数据中的SV(缺失、 重复、 倒位、 插入、 易位)， 通过DELLY和LUMPY， 分别确 定每个样 本中所有结构变异的起始位置、 终止位置以及支持的对端(pair ‑ends， PE)读取数 和拆分读取(split  reads， SR)数。 通过CREST， 除起始位置和终止位置外， 还获得了左/右软 剪切读取数(left /right soft‑clipped reads， LeftSclip/RightSclip)， 利用每个 结构变 异断裂点的起始 位置， 设定具体阈值， 将所有样本中 断裂点分为高置信、 中置信和低置信断 裂点； 筛选标准及流程为高置信断裂点的筛选标准为由三个软件同步检测到的断裂点或在 两个软件中检测到的断裂点(DELLY和LUMPY中的PE&SR， CREST中的LeftSclip&RightSclip 必须全部大于或等于10)， 中置信断裂点必须由两个软件检测到， PE、 SR、 LeftSclip、 RightSclip中至少有一个大于等于10， 但不包括均大于等于10。 低置信断裂点同样由两个 软件检测到， 且PE、 SR、 LeftScl ip、 RightScl ip均小于10； S4： 通过以上筛选流程， 我们获得了HT29亲本及18个MTX梯度耐药细胞系的全部高置 信、 中置信、 低置信断裂点 集， 并将所获得的全部断裂点按照前述5号染色体区域进行划分； S5： 通过PCR、 琼脂糖凝胶电泳及Sanger测序验证DMs区域内全部断裂点、 HSRs区域内全 部高置信断裂点的准确性； S6： 分析全基因组测序SV高置信数据中DMs区域内高置信断裂点接头序列在HT29亲本 及18个MTX梯度耐药细胞系中的检出情况， 获得全基因组测序SV高置信数据中DM s区域内高 置信断裂点接头序列在HT29亲本及18个MTX梯度耐药细胞系中的进化情况。 同时， 通过分析 DMs区域内验证成功的高置信断裂点接头序列在HT29亲本及18个MTX梯度耐药细胞系的 Sanger测序情况， 获得DMs区域内验证成功的高置信断裂点接头序列在HT29亲本及18个MTX 梯度耐药细胞系的进化情况； S7： 继续分析全基因组测序SV高置信数据中HSRs区域 内高置信断裂点接头序列在HT29 亲本及18个MTX梯度 耐药细胞系中的检出情况， 获得全基因组测序SV高置信数据中HSRs区 域内高置信断裂点接头序列在HT29亲本及18个MTX梯度耐药细胞系中的进化情况。 同时， 分 析HSRs区域内验证成功的高置信断裂点接头序列在HT29亲本及18个MT X梯度耐药细胞系的权　利　要　求　书 1/3 页 2 CN 114790440 A 2Sanger测序情况， 获得HSRs区域内验证成功的高置信断裂点在HT29亲本及 18个MTX梯度耐 药细胞系的进化情况的进化情况； 将断裂点数据整理为行为断裂点、 列为样本的0 ‑1矩阵。 其中，“验证成功的DMs区域内高置信断裂点 ”、“验证成功的HSRs区域内高置信断裂点 ”、“验 证成功的DMs区域及HSRs区域内全部高置信断裂点 ”的数据直接在excel中转化为0 ‑1矩阵； “全基因组测序SV数据中全部高置信断裂点 ”的数据， 先提取样本和断裂点位置信息， 并根 据断裂点和样本的对应信息整理为行为 断裂点、 列为样本的0 ‑1矩阵。 将产生的0 ‑1矩阵进 行合并及 去除重复断裂点。 应用R中的dist 函数从细胞系中识别出二进制断裂点， 计算每两 个样本间的几何距离， 得到一个距离矩阵。 随后应用R 中的hclust 函数对该矩阵进行层次聚 类， 得到最终的树型 结构图； S8： 应用UCSC网页的BLAT在线工具并参照Feb.2009对断裂点接头序列进行全基因组序 列的比对， 应用NCBI的BLAST工具进行序列的同源性比对。 此外， 我们通过下载所有的UCSC 的基因组重复元件(LINE、 SINE、 LTR、 LCR)， 然后利用Geno micRanges  R包中的findOverlaps 函数检索高置信断裂点与基因组重复元件 之间的重叠， 获取高置信断裂点所在重复序列的 名称， 并应用一个自定义的R脚本将所有高置信断裂点(包括高置信断裂点起始 位置和终止 位置)以及所在重复序列的名称进行整合， 获得高置信断裂点两断端位于重复序列的分析 结果。 利用以上比对工具， 共同对断裂点接头序列的连接特性进 行分析， 并按照接头序列特 征进行分类， 分类规则 如下：①若接头序列出现平末端或1～4b p微同源或1～4bp 插入序列， 则为NHEJ机制； ②若接头序列出现5～25bp微同源序列， 则为MMEJ机制； ③若接头序列出现 大于30bp的同源序列， 则为SSA机制； ④若接头序列出现大于1kb的同源序列， 则为NAHR机 制；⑤若接头序列出现大于4bp的插入序列 或26～30bp的同源序列或临近的、 无关联的、 未 知的插入序列等复杂重排， 则为M MRDR机制。 2.根据权利要求1所述的一种MTX耐药肿瘤细胞扩增子的进化和形成机制分析方法， 其 特征在于， 所述断裂点接头序列为在分子水平上分析MTX耐药肿瘤细胞扩增子的进化及形 成机制中的高置信断裂点。 3.根据权利要求1所述的一种MTX耐药肿瘤细胞扩增子的进化和形成机制分析方法， 其 特征在于， 所述高置信断裂点为联合应用DELLY、 LUMPY和CREST共同调取全基因组测序结构 变异数据， 并通过设定具体阈值及标准 流程筛选出来的。 4.根据权利要求3所述的一种MTX耐药肿瘤细胞扩增子的进化和形成机制分析方法， 其 特征在于， 所述人 结肠癌细胞为逐步获得DHFR基因扩增的MTX梯度耐药细胞。 5.根据权利要求4所述的一种MTX耐药肿瘤细胞扩增子的进化和形成机制分析方法， 其 特征在于， 所述人结肠癌细胞为逐步获得DHFR基因扩增的人结肠癌HT29  MTX梯度耐药细 胞。 6.根据权利要求1所述的一种MTX耐药肿瘤细胞扩增子的进化和形成机制分析方法， 其 特征在于， 所述 断裂点通过分析其在HT29亲本及18个MTX梯度耐药细胞系中的存在情况以 及接头序列特征， 揭示扩增子的进化过程、 肿瘤耐药克隆进化的全过程以及扩增子形成的 分子机制。 7.根据权利要求1所述的一种MTX耐药肿瘤