(19)国家知识产权局 (12)发明 专利 (10)授权公告 号 (45)授权公告日 (21)申请 号 202210277506.1 (22)申请日 2022.03.21 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 114350824 A (43)申请公布日 2022.04.15 (73)专利权人 西北农林科技大 学深圳研究院 地址 518000 广东省深圳市南 山区粤海街 道高新南四道19 号R4大楼虚拟大学园 B406 (72)发明人 王二龙　王高学　杜辉　刘天强　 凌飞　刘韬　刘佳　陈诚　 (74)专利代理 机构 西安鼎迈知识产权代理事务 所(普通合伙) 6126 3 专利代理师 刘喜保 (51)Int.Cl. C12Q 1/6888(2018.01) C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01)(56)对比文件 CN 112342300 A,2021.02.09 CN 1097972 25 A,2019.0 5.24 CN 112011647 A,2020.12.01 姜虎成.克氏原螯虾转录组测序数据发掘和 性腺发育相关基因功能初步研究. 《中国博士学 位论文全文数据库 农业科技 辑》 .2016,(第3 期),D052-5. Hucheng Jiang等.Identificati on and Characterizati on of Reference Genes for Normalizing Expres sion Data from Red Swamp Crawfish Procambarus clark ii. 《Int J Mol Sci》 .2015,第16卷(第9期),第21591-216 05 页. 姜虎成等.克氏原螯虾内参基因表达稳定性 的评价. 《2015年中国水产学会学术 年会论文摘 要集》 .2015,第1 18页. 审查员 梁欢 (54)发明名称 克氏原螯虾体内组织的内参基因及其引物 (57)摘要 本发明公开了克氏原螯虾感染白斑综合征 病毒后体内组织的内参基因。 所述内参基因为 EIF基因和TBP基因， EIF基因的核苷酸序列如SEQ   ID NO.8所示， TBP基因的核苷酸序列如SEQ  ID  NO.7所示。 本发明还设计了内参基因的引物， 该 引物特异性强， 扩增 效率高。 本发明填补了克氏 原螯虾感染WSSV不同时期、 不同药物处理、 不同 组织没有稳定内参基因的技术空白， 为克氏原螯 虾感染WSSV条件下各组织相关功能基因的表达 定量提供了可靠的分析依据。 权利要求书1页 说明书9页 序列表7页 附图6页 CN 114350824 B 2022.07.01 CN 114350824 B 1.内参基因在克氏原螯虾感染白斑综合征病毒后体内组织基因定量表达分析中的应 用， 所述内参基因为EIF基因和TBP基因， 所述EIF基因的核苷 酸序列如SEQ  ID NO.8所示， 所 述TBP基因的核苷酸序列如SEQ  ID NO.7所示； 所述体内组织 为克氏原螯虾的鳃、 肌肉、 脑、 肝脏、 肠道、 性腺。 2.根据权利要求1所述的应用， 其特征在于， 所述 内参基因EIF、 TBP用于荧光定量PCR分 析。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114350824 B 2克氏原螯 虾体内组织的内参 基因及其引物 技术领域 [0001]本发明属于分子生物学技术领域， 涉及水产动物病害防治， 具体涉及克氏原螯虾 感染WSSV后不同时间、 不同药物处理、 不同组织的最适内参基因的筛选方法及其引物和 应 用。 背景技术 [0002]克氏原螯虾 （ Procambarus  clarkii） 俗名小龙虾， 属节肢动物门Arthropoda、 甲壳 纲Crustac ea、 十足目Decapoda、 鳌虾科Cambaridae。 原产于美国， 2 0世纪30年代至40年代引 入中国， 初期作为入侵物种对环境产生较大危害， 后经驯化成为水产经济动物。 目前在 全国 各地都有广泛养殖且规模日益增大。 2019年克氏原螯虾产值已突破4000亿元， “十三五”以 来， 据不完全统计， 2016～2020年各类机构共授予了17个小龙虾区域品牌。 在国家和各地政 策的大力扶持， 小龙虾产业规模扩张的趋势还存在强大的惯性， 在 “十四五”时期小龙虾产 业整体还将维持中 高速增长 。 [0003]白斑综合征病毒 （White  Spot Syndrome  Virus， WSSV） 是一种环状双链的DNA病 毒， 病毒粒子为卵圆形或杆状， 病毒 结构由囊膜和核衣壳组成， 是迄今对包括小 龙虾和对虾 在内的甲壳类动物养殖业危害最大的一种病毒。 在1992年， WSSV首次被发现于中国台北对 虾养殖场， 随后迅速扩散至亚洲各国。 WSSW能够进行水平传播、 垂直传播和种间传播， 传染 能力强， 死亡率高。 其对小龙虾的感染最早见于2006年5月的浙江省舟山， 后续几年在湖北、 江苏、 浙江等小龙虾养殖大省均见报道。 现在已成为威胁小龙虾产业健康发展的一种重要 病害。 [0004]实时荧光定量PC R （RT‑qPCR） 技术是一种常见的分子生物 学方法， 广泛用于精确测 定目的基因的表达量， 但其精确度高度依赖于所选择 的内参基因， 内参基因的稳定性和表 达丰度是选取最适内参基因的关键因素。 研究表明， 不同环境、 不同刺激、 不同阶段等条件 下内参基因的表达情况会发生改变， 且不同组织的最适内参基因并不完全相同。 鉴于克氏 原螯虾在感染WSSV 不同时间 （阶段） 、 不同药物处理、 不同组织的内参基因尚未见报道， 为进 一步研究WSSV感染对 克氏原螯虾体内组织的相关功能基因表达的影响， 有必 要对克氏原螯 虾感染WS SV病毒后的内参基因进行筛 选。 发明内容 [0005]本发明目的之一在于提供克氏原螯虾感染WSSV病毒不同时间 （阶段） 、 不同药物处 理、 不同组织的最适内参基因。 本发明目的之二在于提供所述最适内参基因的引物。 本发明 目的之三在于提供最 适内参基因及其引物在基因表达中的应用。 [0006]基于本发明上述目的的实现， 本发明可以满足实时荧光定量PCR分析克氏原螯虾 体内组织目的基因转录表达水平的要求， 为克氏原螯虾感染WSSV时体内组织相关功能基因 的表达定量提供可靠的分析依据。 [0007]为实现发明上述目的， 解决现有问题， 本发明采用的技术方案为： 克氏原螯虾感染说　明　书 1/9 页 3 CN 114350824 B 3