(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210275023.8 (22)申请日 2022.03.21 (71)申请人 江苏科技大学 地址 212008 江苏省镇江市京口区梦溪路2 号 (72)发明人 李刚　梁帅　徐安英　钱荷英　 刘明珠　 (74)专利代理 机构 南京苏高专利商标事务所 (普通合伙) 32204 专利代理师 丁静静 (51)Int.Cl. C12Q 1/6888(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 蓖麻蚕EST-SSR分子标记及其应用 (57)摘要 本发明公开了一种蓖麻蚕EST ‑SSR分子标记 及其应用， 属于分子生物学和蚕品种鉴别技术领 域。 本发明从蓖麻蚕转录组序列获得了EST ‑SSR  12个分子标记位点信息， 并设计合成了12对扩增 效率高、 多态性丰富的SSR引物。 利用本发明建立 的方法， 以2 0份蓖麻蚕种质为材料进行了遗传多 样性分析。 利用PCR扩增和电泳检测技术可完成 SSR标记的检测， 可直接应用于蓖麻蚕种质资源 的鉴定和遗传多样性分析， 在DNA水平揭示各品 系的遗传变异， 也为分子标记辅助育种奠定了良 好的分子 基础。 权利要求书1页 说明书9页 序列表8页 附图3页 CN 114457172 A 2022.05.10 CN 114457172 A 1.一种蓖麻蚕EST ‑SSR分子标记， 其特征在于， 所述EST ‑SSR分子标记的核苷酸序列如 SEQ ID NO:1～12所示。 2.权利要求1所述蓖麻蚕EST ‑SSR分子标记在蓖麻蚕种质资源的鉴定、 蓖麻蚕亲缘关系 或遗传多样性分析、 蓖麻蚕遗传育种中的应用。 3.蓖麻蚕EST ‑SSR分子标记引物， 其特征在于， 所述分子标记引物的核苷酸序列如SEQ   ID NO:13～3 6所示。 4.权利要求3所述蓖麻蚕EST ‑SSR分子标记引物在蓖麻蚕种质资源的鉴定、 蓖麻蚕亲缘 关系或遗传多样性分析、 蓖麻蚕分子标记辅助育种中的应用。 5.根据权利 要求4所述的应用， 其特征在于， 利用权利 要求3所述的蓖麻蚕EST ‑SSR分子 标记引物进行PCR反应的反应 体系及扩增条件如下： PCR反应体系如下： 2.5 μL  10×PCR buffer， 2 μL  2.5mmol/L  dNTP， 1μL  10mmol/L上游 引物、 1μL  10mmol/L下游引物， 0.3 μL  DNA聚合酶， 1μL  500ng/ μL  DNA模板， 加入ddH2O定容 到反应终体积25 μL； PCR扩增条件如下： PCR扩增在BIO  RAD T100 Thermal Cycler上进行； 反应条件设为95 ℃预变性3min， 95℃变性30s， 退火30s， 72℃延伸30s； 共35个循环， 72℃再延伸5min， 最后反 应终止于12℃。 6.包含权利要求3所述蓖麻蚕EST ‑SSR分子标记引物的试剂盒。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114457172 A 2蓖麻蚕EST ‑SSR分子标记及其应用 技术领域 [0001]本发明属于分子生物学和蚕品种鉴别技术领域， 具体涉及蓖麻蚕EST ‑SSR分子标 记及其应用。 背景技术 [0002]蓖麻蚕(Philosamia  cynthia ricini)又称木薯蚕、 印度蚕， 是一种具有多化性， 在适宜的环境条件下无滞育期的吐丝类经济昆虫。 16世纪就已经被印度人驯化饲养， 20世 纪前后被引进到20多个 国家与地区进行饲养繁殖， 40年代被引进到我国东北、 华东和华南 等地。 蓖麻蚕是广食性昆虫， 除了摄食蓖麻叶外， 还可食用木薯、 臭椿和马桑等叶片 。 蓖麻蚕 具有发育较快、 易饲养、 抗病性 强、 蚕体健壮、 背光群集等优点， 已经成为我国仅次于家蚕和 柞蚕的第三大经济昆虫， 亦可作为良好的遗传研究素材。 针对蓖麻蚕开展的研究还相对比 较少， 仅有报道采用ISSR方法在几个品种中检测 遗传多样性的分析， 但ISSR标记存在重复 性差等缺点， 目前未见有利用蓖麻蚕转录组序列开 发EST‑SSR标记的报道。 针对蓖麻蚕开展 标记选择， 用于品种分子甄别， 尤其是在生产优良品种的应用显得 尤为迫切需要。 [0003]微卫星(Micr osatellite)又称简单重复序列(Simple  Sequence Repeat， SSR)， 是 基因组组以少数几个核苷酸(多 数为2‑4个)为单位多次串联重复组成的长达几十个核苷 酸 的序列。 SSR包括基因组SSR(Geno mic SSR,gSSR)和表达区EST ‑SSR(genic ‑SSR或EST‑SSR)。 gSSR是基于基因组序列开发的， 而EST ‑SSR则是存在于表达的基因序列内的SSR， 不包括内 含子及非表达调控区中的SSR位点。 由于EST ‑SSR可利用数据库中的EST序列开发， 比基因组 SSR更加经济， 而且EST ‑SSR来源于DNA的转录 区域， 比gSSR标记具有更高的通用性， 因此近 年来EST‑SSR标记在动植物品种资源中得到广泛开发及应用。 发明内容 [0004]发明目的： 本发明要解决的技 术问题是提供蓖麻蚕EST ‑SSR分子标记。 [0005]本发明还要解决的技术问题是提供利用上述蓖麻蚕EST ‑SSR分子标记设计EST ‑ SSR分子标记引物。 [0006]本发明最后要解决的技术问题 是提供上述蓖麻蚕EST ‑SSR分子标记及引物蓖在麻 蚕种质资源的鉴定、 蓖麻蚕亲缘关系或遗传多样性分析、 蓖麻蚕遗传育种中的应用。 [0007]技术方案： 为 解决上述 技术问题， 本发明提供如下技 术方案： [0008]一种蓖麻蚕EST ‑SSR分子标记， 所述EST ‑SSR分子标记的核苷酸序列如SEQ  ID NO: 1～12所示。 [0009]上述蓖麻蚕EST ‑SSR分子标记在蓖麻蚕种质资源的鉴定、 蓖麻蚕亲缘关系或遗传 多样性分析、 蓖麻蚕遗传育种中的应用。 [0010]蓖麻蚕EST ‑SSR分子标记引物， 所述分子标记引物的核苷酸序列如SEQ  ID NO:13 ～36所示。 [0011]上述蓖麻蚕EST ‑SSR分子标记引物在蓖麻蚕种质资源的鉴定、 蓖麻蚕亲缘关系或说　明　书 1/9 页 3 CN 114457172 A 3