(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210283268.5 (22)申请日 2022.03.22 (71)申请人 河南省农业科 学院植物保护研究所 地址 450000 河南省郑州市金 水区花园路 116号 (72)发明人 秦艳红　王凤丽　王飞　鲁传涛　 高素霞　文艺　刘玉霞　王素霞　 杨瑾　李雪梦　戚文平　刘国彬　 (74)专利代理 机构 北京科家知识产权代理事务 所(普通合伙) 11427 专利代理师 周瑜 (51)Int.Cl. C12N 15/11(2006.01) C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/6844(2018.01)C12R 1/94(2006.01) (54)发明名称 山药潜隐病毒的RT-LAMP检测引物组及检测 方法 (57)摘要 本发明公开了山药潜隐病毒的RT ‑LAMP检测 引物组， 其引 物组包括一对外引 物YLV‑F3、 YLV‑ B3， 一对内引物YLV ‑FIP、 YLV ‑BIP， 一对环引物 YLV‑LF、 YLV‑LB， 成功建立了YLV的环介导恒温快 速扩增的可视化检测体系， 该检测体系反应速度 快， 灵敏度高， 特异性强， 操作简单， 可以直接观 察到检测结果。 为YLV的田间检测提供了一种方 便， 快速可靠的方法。 权利要求书1页 说明书4页 序列表2页 附图3页 CN 114606229 A 2022.06.10 CN 114606229 A 1.山药潜隐病毒的RT ‑LAMP检测引物组， 其特 征是： 包括如下三个引物对： 外引物： YLV‑F3： 5’ ‑TCCTTTCCCCCTGTGATTTC‑3’； YLV‑B3:5’ ‑TCACTTGGGCTTTTATGCTTG‑3’； 内引物： YLV‑FIP： 5’ ‑GCTGAGGGGTTGGTTCGAAGACCAGAGCAATGTCCTTGTGCGT‑3’； YLV‑BIP： 5’ ‑GGTTGAACAGCAGC CGGATTCCATTACAACGATAGAT TTGCCG‑3’； 环引物： YLV‑LF： 5’ ‑GCCTAGAGAGA AGCTCGCTCATA ‑3’； YLV‑LB： 5’ ‑CTACATAGTCA AAGCAGTCA AAGG‑3’。 2.权利要求1所述的山药潜隐病毒的RT ‑LAMP检测引物组在检测山药潜隐病毒的RT ‑ LAMP检测方法， 其特 征在于： 包括以下步骤： (1)病毒总 RNA提取及cDNA的合成： 按照柱式植物总 RNA提取试剂盒说明书要求提取 叶 片总RNA， 按照PrimeScriptTMⅡ1st Strand cDNA Synthesis  Kit合成cDNA； (2)RT‑LAMP扩增： 以经步骤(1)提取的RNA为模板合成cDNA， 采用权利要求1所述的RT ‑ LAMP检测引物进行RT ‑LAMP反应。 3.根据权利要求2所述的山药潜隐病毒 的RT‑LAMP可视化检测方法， 其特征在于： 步骤 (2)所述的反应体系25 μL： 模板1μL、 1 ×ThermoPol  Buffer、 YLV ‑FIP和YLV ‑BIP引物各1.6 μ mol·L‑1； 、 YLV‑F3和YLV‑B3引物各0.2 μmol ·L‑1、 YLV‑LF和YLV‑LB引物各0.4 μmol ·L‑1、 Mg2+ 6mM、 dNTPs  1.4mM、 Bst  DNA polymerase 8U， ddH2O补足25 μL。 4.根据权利要求2所述的山药潜隐病毒 的RT‑LAMP可视化检测方法， 其特征在于： 步骤 (2)所述的RT ‑LAMP反应条件为58℃ ‑65℃反应1h， 85℃反应5mi n， 冰上终止反应。 5.根据权利要求2所述的山药潜隐病毒的RT ‑LAMP可视化检测方法， 其特征在于： RT ‑ LAMP反应结束后， 取5 μL  RT‑LAMP产物进行琼脂糖凝胶电泳分析， 出现瀑布状条带的判断为 阳性， 无条带判断为阴性； 同时向剩余反应产物中加入0.2 μL的SYBR  Green I， 肉眼观 察RT‑ LAMP产物颜色变化， 绿色为阳性， 橙色为阴性。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114606229 A 2山药潜隐病毒 的RT‑LAMP检测引物组及检测方 法 技术领域 [0001]本发明属于分子生物学技术领域， 具体是涉及山药潜隐病毒的RT ‑LAMP检测引物 组及检测方法。 背景技术 [0002]病毒病是威胁山药生产的重要病害， 影响山药的品质和 产量， 造成经济损失。 山药 潜隐病毒(Yam  latent virus,YLV)是山药上的重要病毒， 属于香石竹潜隐病毒属 (Carlavirus)。 建立快速准确检测山药病毒的方法在病毒病防控中具有重要意义。 LAMP是 2000年由日本的Not omi等发明的一种能够在恒温条件 下快速扩增核酸片段的技术。 特异性 核苷酸延伸是通过具有链置换活性的DNA聚合酶和 两对内外引物实现 的。 LAMP已被广泛应 用于病毒检测领域。 Fukuta等建立了日本山药花叶病毒(Japanese  yam mosaic virus, JYMV)的检测技术。 Chukwuemeka等建立了山药花叶病毒(Yam  mosaic virus,YMV)的RT ‑ LAMP检测体系， 目前尚无关于 YLV RT‑LAMP检测方法的报道。 [0003]现有RT‑PCR和荧光定量PCR等分子检测技术虽然具有高特异性和灵敏度的特点， 但需要特定的仪器设备和专业的实验人员来完成， 不适用于基层检测。 血清学检测需要特 异性抗血清， 制作过程繁杂、 成本昂贵， 易出现假阳性。 生物学鉴定和电镜观 察费时费工， 需 要检测样品中病毒含量高。 RT ‑LAMP作为一种新型的检测技术， 具有简便、 快速、 特异等特 点， 不需要对模板进行热变性， 可在等温条件下进行反应， 短时间内即可获得试验结果。 基 于此， 本研究建立了针对YLV的RT ‑LAMP快速检测技 术。 发明内容 [0004]本发明所要解决的技术问题， 是克服现有技术的不足， 对YLV  RT‑LAMP检测技术的 反应条件进行优化， 验证RT ‑LAMP扩增的特异性和灵敏度， 建立一种YLV的快速、 特异性好、 灵敏度高的检测技术， 应用于山药田间样品的检测， 为山药病毒病害的监测防控提供技术 支持， 提供一种山药潜隐病毒的RT ‑LAMP检测引物组及检测方法。 [0005]本发明所采用的技 术方案是： [0006]山药潜隐病毒的RT ‑LAMP检测引物组， 包括一对外引物YLV ‑F3、 YLV‑B3， 一对内引 物YLV‑FIP、 YLV‑BIP， 一对环引物YLV ‑LF、 YLV‑LB， 其核苷酸序列分别如下 所示： [0007]外引物： [0008]YLV‑F3： 5’ ‑TCCTTTCCCCCTGTGATTTC‑3’； [0009]YLV‑B3:5’ ‑TCACTTGGGCTTTTATGCTTG‑3’； [0010]内引物： [0011]YLV‑FIP： 5’ ‑GCTGAGGGGTTGGTTCGAAGACCAGAGCAATGTCCTTGTGCGT‑3’； [0012]YLV‑BIP： 5’ ‑GGTTGAACAGCAGC CGGATTCCATTACAACGATAGAT TTGCCG‑3’； [0013]环引物： [0014]YLV‑LF： 5’ ‑GCCTAGAGAGA AGCTCGCTCATA ‑3’；说　明　书 1/4 页 3 CN 114606229 A 3