(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210282373.7 (22)申请日 2022.03.22 (71)申请人 北京中瑞恒达科技有限公司 地址 102200 北京市昌平区城北街道南关 路西广武路北8号楼 203 (72)发明人 宋衍燕　刘国栋　聂艳妮　 (74)专利代理 机构 北京世衡知识产权代理事务 所(普通合伙) 11686 专利代理师 肖淑芳 (51)Int.Cl. C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/01(2006.01) (54)发明名称 一种幽门螺杆菌四环素耐药的高分辨溶解 曲线检测方法及试剂盒 (57)摘要 一种幽门螺杆菌四环素耐药的高分辨溶解 曲线检测方法及试剂盒， 本发明针对猪螺杆菌的 特异基因分析， 提供了用于检测猪螺杆菌的实时 荧光定量PCR的引物和探针， 其核苷酸序列分别 如SEQ ID NO:1， SEQ  ID NO:2， SEQ  ID NO:3所 示。 本发明还提供了对猪螺杆菌进行定量检测的 方法和检测试剂盒。 分发明的检测方法具有检测 准确， 灵敏度高， 特异性强， 操作简便快捷， 具有 良好的实际标本 检测能力。 权利要求书1页 说明书6页 附图2页 CN 114908178 A 2022.08.16 CN 114908178 A 1.一种幽门螺杆菌四环素耐药基因16S  rDNA突变检测的高分辨溶解曲线引物， 其特征 在于， 所述检测引物及其核苷酸序列如下 SEQ ID NO.1： 5’ ‑AAAGGAATAGACGGGGACCC‑3’ SEQ ID NO.2： 5’ ‑GATTCTCTCAATGTCAAGCCTAGGT‑3’ 2.如权利 要求1所述的幽门螺杆菌四环素耐药基因16S  rDNA突变检测的高分辨溶解曲 线检测的引物， 其用于检测幽门螺杆菌四环素耐药。 3.含权利要求1或2所述引物的幽门螺杆菌四环素耐药基因16S  rDNA高分辨溶解曲线 突变检测试剂盒。 4.根据权利3所述的幽门螺杆菌四环素耐药基因16S  rDNA高分辨溶解曲线突变检测试 剂盒， 其特征在于HRM试剂包括饱和荧光染料， 所述饱和荧光染料为Lc  Green、 Ly  Green或 者Eva Green。 5.根据权利3所述的幽门螺杆菌四环素耐药基因16S  rDNA高分辨溶解曲线突变检测试 剂盒， 其特征在于， 还包括： 高分辨溶解曲线反应液、 阴性模板和阳性模板， 所述阴性模板为 四环素敏感的幽门螺杆菌DNA， 所述阳性模板为四环素耐药的幽门螺杆菌DNA。 6.如权利 要求3或4或5所述的幽门螺杆菌四环素耐药基因16S  rDNA高分辨溶解曲线检 测试剂盒在检测幽门螺杆菌四环素耐药中的应用。 7.一种幽门螺杆菌四环素耐药检测方法， 其特征在于， 以样品总DNA为模板， 以权利要 求1所述的引物进行高分辨溶解曲线扩增， 根据溶解曲线判定结果。 8.如权利要求7所述幽门螺杆菌四环素耐药检测检测方法， 其特征在于， 高分辨溶解曲 线反应体系为 9.根据权利要求7或8所述的方法， 其特征在于， 所述高分辨熔解曲线反应程序为： 95℃ 预变性2mi n， 1个循环； 95℃变性10s， 54℃～6 0℃退火3 0s， 40个循环； 溶解曲线分析。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114908178 A 2一种幽门螺杆菌四环素耐药的高分辨 溶解曲线检测方 法及试 剂盒 技术领域 [0001]本发明涉及分子生物学领域， 特别是涉及用于幽门螺杆菌四环素耐药检测的高分 辨溶解曲线方法的引物， 本发明还涉及利用所述的引物检测HP四环素耐药的方法和试剂 盒。 背景技术 [0002]幽门螺杆菌(Helicobacter  pylori， 简称Hp)是世界卫生组织癌症研究机构   (WHO/IARC)规定的第 Ⅰ类致癌因子， 细菌中 唯一的一个。 HP是各种消化道  疾病的主要病因， 它与慢性 胃炎、 胃/十二指肠溃疡、 微粘膜组织相关淋巴瘤  (MALT)和胃癌密切相关。 。 迄今 为止， 我国一共发布了五次 《全国幽门螺杆  菌感染处理共识》 ， 从最初的三联疗法， 到现在 的四联疗法， 抗生素的使用是必  不可少的。 目前在使用的第五次共识中， 采用了7种抗生素 的组合， 并且不推  荐一线方案， 根据患者情况和当地HP的耐药情况具体选择。 其中包含四 环素的 方案有三种， 因此四环素在幽门螺杆菌治疗中有着重要的作用， 特别是对于阿  莫 西林过敏者， 只能选择包含四环素的方案。 虽然根治幽门螺杆菌是治疗其引  发胃部疾病的 根本办法， 但是近年来我国的HP根治率却在不断的下降， 这其中  的主要原因就是抗生素耐 药不断上升的结果。 虽然四环在我国耐药率目前 处于 较低水平， 平均为8.8％， 但是研究显 示有逐年上升的趋势， 所以需要我们密切  的关注， 特别是对于HP个体化治疗， 必须对四环 素的耐药性进行检测。 [0003]幽门螺杆菌对四环素的耐药主要是由于其16S  rDNA的四环素结合位点发生突变 导致的， 虽然推测还有抗菌素灭活酶、 外排泵机制、 膜通透性改变和生物膜等原因， 但是大 量的研究显示这些都是辅助作用， 其耐药 的根本原因还是四环素结合位点的突变。 国内外 的研究显示， 四环素耐药的幽门螺杆菌的16S rDNA突变位点为AGA926 ‑928。 其三碱基突变 引起HP对四环素高水平耐药， 单碱基或者两碱基突变导致低水平耐药。 我们分析多个研究 结果显示， 这三个碱基的突变有多种方式， 单一位置可能有多种突变， 再加上两种或者三种 交叉组合， 实际中会出现多种突变组合。 [0004]对于HP对四环素的耐药检测， 传统的分离培养虽然是金标准， 但是这一方法耗时 耗力， 分离率低， 对实验室和技术人员要求高， 因此在实际中无法开展。 目前使用最多的突 变检测方法是实时荧光P CR探针法， 但是对于HP四环素耐药这种连续突变， 并且存在 多种组 合， 需要使用多种探针和组合， 因此难以实现。 发明内容 [0005]针对以上情况， 发现高分辨溶解曲线(High ‑resolution  melt,HRM)比较适合HP   16S rDNA四环素耐药相关突变检测， 这一方法 的原理在于通过一对引物的扩增， 经过高分 辨溶解曲线， 能够同时检测多种突变， 同时具有很高的灵敏度和特异性。 为此， 研发了一种 用于检测幽门螺杆菌四环素16S  rDNA耐药突变的HRM方法。 该方法灵敏度高、 特异性好， 并说　明　书 1/6 页 3 CN 114908178 A 3