(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210283316.0 (22)申请日 2022.03.22 (71)申请人 西北农林科技大 学 地址 712100 陕西省咸阳市杨凌示范区 邰 城路3号 (72)发明人 蓝康澍　李雪兰　张珂菁　蓝昕蕊　 吕润语　蓝贤勇　王勇胜　潘传英　 (74)专利代理 机构 西安通大专利代理有限责任 公司 6120 0 专利代理师 范巍 (51)Int.Cl. C12Q 1/6888(2018.01) C12Q 1/6858(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种牛CRY1基因的InDel标记在繁殖性状早 期选择中的应用 (57)摘要 本发明公开了一种牛CRY1基因的InDel标记 在繁殖性状早期选择中的应用。 以待测奶牛全基 因组DNA为模板， 通过PCR扩增、 琼脂糖凝胶电泳， 鉴定CRY1基因NC_037332.1:g.70335656 ‑ 70335661位InDel位点 的基因型。 根据CRY1基因 InDel位点的不同基因型与卵巢相关性状的关联 分析结果， 确定了CRY1基因InDel位点的基因型 可作为提高奶牛繁殖力的DNA标记。 本发明通过 快速、 精准的检测与繁殖力密切相关的InDel标 记， 可快速建立奶牛优势遗传资源群体， 从而加 快奶牛繁殖性状的标记辅助选择育种进程。 权利要求书1页 说明书6页 序列表1页 附图1页 CN 114703293 A 2022.07.05 CN 114703293 A 1.一种牛CRY1基因插 入/缺失多态性的检测方法， 其特 征在于： 包括以下步骤： 以待测牛基因组DNA为模板， 通过PCR扩增包含CRY1基因NC_037332.1:g.70335656 ‑ 70335661位6 ‑bp插入/缺失多态性位点的片段； 对PCR的扩增片段进行琼脂糖凝胶电泳； 根 据琼脂糖凝胶电泳结果 鉴定该插 入/缺失多态性 位点的基因型。 2.根据权利要求1所述一种牛CRY1基因插入/缺失多态性的检测方法， 其特征在于： 所 述PCR的扩增引物为： 上游引物： 5 ’ ‑CGTATGTGT TCTAACTCCTTCCCT‑3’； 下游引物： 5 ’ ‑ATCTAGACAGA AAAGACCCCAGT‑3’。 3.根据权利要求1所述一种牛CRY1基因插入/缺失多态性的检测方法， 其特征在于： 所 述PCR的反应 体系包括5 0ng/ μL的基因 组DNA 1.0 μL以及10pmo l/ μL的上、 下游引物各0.5 μL。 4.根据权利要求1所述一种牛CRY1基因插入/缺失多态性的检测方法， 其特征在于： 所 述PCR的扩增反应程序为： 95℃预变性5min； 94℃变性30s， 68℃退火30s， 72℃延伸20s， 18个 循环， 每循环后退火温度减1℃； 5 0℃退火3 0s， 72℃延伸20s， 3 0个循环； 72℃延伸10mi n。 5.根据权利要求1所述一种牛CRY1基因插入/缺失多态性的检测方法， 其特征在于： 所 述琼脂糖凝胶电泳采用质量浓度为3.0％的琼脂糖凝胶。 6.根据权利要求1所述一种牛CRY1基因插入/缺失多态性的检测方法， 其特征在于： 根 据琼脂糖凝胶电泳结果， 所述插入/缺失多态性位点的插入/插入基因型表现为199bp的一 条带纹， 插入/缺失基因型表现为199bp和193bp的两条带纹， 缺失/缺失基因型表现为193bp 的一条带纹。 7.如权利要求1所述的牛CRY1基因插入/缺失多态性的检测方法在奶牛分子标记辅助 选择育种中的应用。 8.牛CRY1基 因NC_037332.1第70335656 ‑70335661位插入/缺失多态性位点检测试剂在 奶牛分子标记辅助选择育种中的应用。 9.根据权利要求7或8所述的应用， 其特征在于： 所述插入/缺失多态性位点的插入/插 入基因型 可以作为 提高奶牛繁殖力的DNA标记。 10.一种牛CRY1基因插入/缺失多态性的检测试剂盒， 其特征在于： 该试剂盒包括用于 扩增牛CRY1基因NC_0 37332.1第70 335656‑70335661位插入/缺失多态性 位点的引物。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114703293 A 2一种牛CRY1基因的InDel标记在繁殖性状 早期选择中的应用 技术领域 [0001]本发明属于生物技术与家畜育种领域， 涉及基因插入/缺失多态性(InDel)的检 测， 特别涉及快速、 精准的检测与奶牛繁殖力相关的CRY1基因I nDel标记。 背景技术 [0002]动物育种技术主要包括以表型和表型值为基础的常规育种技术以及以DNA多态为 基础的分子育种技术。 作为分子育种技术体系的重要组成部分， 标记辅助选择(marker ‑ assisted  selection， MAS)育种技术根据与遗传性状显著相关的DNA标记进行性状选择， 通 过在DNA水平上分析个体的遗传组成， 实现对基因型的直接选择， 提高育种目标的定向性， 在早期选择、 无损害性状评价和选择及提高回交育种效率等方面具有优越性。 寻找重要功 能基因、 筛查重要基因遗传变异 位点， 并分析重要功能基因遗传变异 位点与性状的相关性， 是标记辅助选择技 术应用的前提和关键 。 [0003]插入/缺失多态性(insertion/deletion,InDel)是指DNA序列上核苷酸片段的插 入或缺失而引起的DNA序列的改变， 插入或缺失片段的长度在1 ‑50bp之间。 从DNA水平上对 小片段核苷酸的差异进行InDel检测， 利用InDel分析个体基因组， 可以更好地解释个体的 表型差异， 在动物分子 育种中具有重要意 义。 [0004]随着比较基因组学的深入研究， InDel为理论研究和遗传育种应用提供了大量的 遗传信息， 其作为新一代的遗传学鉴定标记， 兼具SNP的优点。 InDel与SNP均是源于单突变 事件， 突变频率较低， 相对比较稳定； 在结构上属于二等位基因多态性， 等位基因都固定且 已知， 能够通过很小的扩增子进 行扩增(<50b p)。 作为一种重要的遗传标记 来源， InDel遍布 于整个基因组， 频率仅次于SNP， 其中约三分之一位于已知的基因区域内， 还有一些位于决 定基因功能的关键性区域， 如启动子区和外 显子区。 [0005]2005年Schnabel等人结合SSR标记和InDel标记对控制奶牛产奶量进行了研究， 并 成功进行了精细定位。 InDel的研究目前多集中在人类和各种农作物(如水稻和玉米等)的 基因组研究中， 对反刍家畜的功能性基因的I nDel标记的挖掘与应用亟 待深入。 [0006]同时提高产奶量和提升奶牛繁殖力， 一直是养殖行业的难题之一。 为改善奶牛产 奶量增加但繁殖力持续低下 的现状， 需要在DNA水平上筛查和检测与奶牛繁殖力密切相关 的DNA标记。 隐花色素1(Cryptochro me 1,CRY1)基因是生物钟基因之一， 为生物钟负调控系 统的重要组成。 [0007]目前尚未 见到牛CRY1基因上用于卵巢相关性状标记辅助选择的DNA标记的报道。 发明内容 [0008]本发明的目的在于提供一种牛C RY1基因的InDel标记在 繁殖性状早期选择中的应 用， 通过对 牛CRY1基因InDel标记的检测， 从而可以利用分子标记辅助选择加快奶牛良种选 育速度。 [0009]为达到上述目的， 本发明采用了以下技 术方案：说　明　书 1/6 页 3 CN 114703293 A 3