(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210282340.2 (22)申请日 2022.03.22 (71)申请人 北京中瑞恒达科技有限公司 地址 102200 北京市昌平区城北街道南关 路西广武路北8号楼 203 (72)发明人 刘国栋　宋衍燕　聂艳妮　 (74)专利代理 机构 北京世衡知识产权代理事务 所(普通合伙) 11686 专利代理师 肖淑芳 (51)Int.Cl. C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/01(2006.01) (54)发明名称 一种猪螺杆菌检测的引物、 探针及方法和试 剂盒 (57)摘要 本发明针对猪螺杆菌的特异基因分析， 提供 了用于检测猪螺杆菌的实时荧光定量PCR的引物 和探针， 其核苷酸序列分别如SEQ  ID NO:1， SEQ   ID NO:2， SEQ  ID NO:3所示。 本发明还提供了对 猪螺杆菌进行定量检测的方法和检测试剂盒。 分 发明的检测方法具有检测准确， 灵敏度高， 特异 性强， 操作简便快捷， 具有良好的实际标本检测 能力。 权利要求书1页 说明书8页 附图3页 CN 114592078 A 2022.06.07 CN 114592078 A 1.一种猪螺杆菌(Helicobacter  suis,HS)检测的实时荧光PCR的特异性引物； 其核苷 酸序列为： HS‑F:5’ ‑TGTGGCTAGATGT TTGCCAATTT‑3’ HS‑R:5’ ‑GCTTTGGCTGCAGGCAA‑3’ 2.与权利要求1所述引物配合使用的荧 光探针。 3.根据权利要求2所述的荧 光探针， 其核苷酸序列为： (HEX)5’ ‑CCACGCCTGCAGGCAACAAATCC‑3’(BHQ1) 4.一种猪螺杆菌检测的方法， 其特征在于， 以样品总DNA为模板， 以权利要求2或者3所 述的引物和权利要求 4所述探针进行实时荧 光定量PCR， 根据扩增曲线判定结果。 5.如权利要求4所述的猪螺杆菌的检测方法， 其特征在于， 实时荧光定量PCR的反应体 系为： 6.根据权利要求4或者5所述的方法， 其特征在于， 所述实时荧光定量PCR反应程序为： 95℃预变性10mi n， 1个循环； 95℃变性10s， 6 0℃退火3 0s， 45个循环。 7.含有权利要求1所述引物和/或权利要求2或3所述探针的试剂盒。 8.根据权利要求7所述的试剂盒， 其还包括： 荧光定量反应液、 阴性模板和阳性模板， 所 述阴性模板为去 核酸水， 所述阳性模板为0.3 56fg/ μl～3.5 6ng/ μl的猪螺杆菌基因 组DNA。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114592078 A 2一种猪螺杆菌检测的引物、 探针及方 法和试剂盒 技术领域 [0001]本发明涉及分子生物学领域， 特别是涉及用于检测猪螺杆菌的荧光定量  PCR的引 物和探针， 本发明还涉及利用所述引物和探针 检测猪螺杆菌的方法和试剂盒。 背景技术 [0002]猪螺杆菌(Helicobacter  suis)是一种人兽共患的病原菌， 它不仅 感染猪类同时 也感染人类。 在 全球有报道的范围内， 猪螺杆菌在猪类感染中超过了60％， 对各个年龄的猪 都有感染， 主要造成猪胃(食管区)溃疡。 众所周知， 幽门螺杆菌是人类胃部的主要疾病的致 病因子， 是世界卫生组织癌症机构规定的第 Ⅰ类致癌因子。 相关研究表面， 人类 胃部除了猪 螺杆菌定植， 还有 其他一些螺杆菌定植(Non ‑Helicbacter  pylori helicobacters， NHPH)， 这其中最重要的就是猪螺杆菌。 根据相关报道， 猪螺杆菌在胃病患者中的检出率约为 1.8％ ∽6.94％， 并且有逐年上升的趋势。 研究结果表明， 感染猪螺杆菌发展为粘膜相关组织淋巴 瘤(MALT淋巴瘤)的可能性要高于猪螺杆菌感染。 最新的研究表明， 帕金森患者中猪螺杆菌 感染率要明显高于普通人群。 对于猪螺杆菌感染人类的途径， 目前尚不清楚， 推测可能是在 食品加工和流通环节造成了污染， 有报道显示在市场中的猪胃和猪肉馅中检测到了猪螺杆 菌的存在， 其在这些食品中的存活时间可达48小时。 [0003]猪螺杆菌生长条件与幽门螺杆菌类似， 但是更为苛刻， 因此其分离培养也更为困 难。 自从1990年第一次发现猪胃部中存在这一细菌， 科学家 一直尝试对其进 行分离培养， 都 未能成功。 直到2008年比利时科学家第一次从猪胃中成功分离， 人们才真正拿到了这一菌 株。 又经过多年的努力， 日本科学家于2016年 成功从人类患者胃部 分离到了猪螺杆菌， 进一 步证实了其对人类的致病性。 目前， 世界上研究猪螺杆菌的实验室并不多， 主要为比利时、 日本和中国。 随着人群中越来越多的猪螺杆菌感染病例报道， 这一细菌受到了更为广泛的 关注。 同时我国也是生猪养殖 大国， 因此， 研究猪螺杆菌有非常重要的流行病学意 义。 [0004]由于猪螺杆菌分离培养困难， 其分子生物学检测具有十分重要的意义， 但是这一 工作一直进展缓慢。 2011年， 比利时科学家首次公布了猪螺杆菌全基因组序列， 这为设计构 建相关分子生物检测产品奠定了基础。 我国研究者也曾报告了基于普通PCR的猪螺杆菌检 测方法(①王艳冬.猪螺杆菌聚合 酶连锁反应检测方法的建立及初步应用[D],北京， 中国疾 病预防控制中心。 ②郑浩,姚火春.  PCR法检测猪胃中的螺杆菌[J],中国人兽共患病杂志, 2004,11:983 ‑986.)目前， 在传染病诊断和病原菌检测方面， 实时荧光PCR应用最为广泛， 这 一方法检测灵敏度高， 特异性 好。 发明内容 [0005]针对目前猪螺杆菌分子生物快速检测技术缺乏的情况， 提供一套用于猪螺杆菌检 测的实时荧光P CR检测体系， 该方法灵敏度好， 特异 性高， 既可以用于菌株鉴定， 也可以直接 用于人或猪的样本检测， 还可以用于细菌分离 培养前的筛查。 [0006]本发明的目的在于提供用于猪螺杆菌检测的实时荧光PCR的特异性引物和探针；说　明　书 1/8 页 3 CN 114592078 A 3