(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 20221028184 4.2 (22)申请日 2022.03.22 (71)申请人 四川大学 地址 610065 四川省成 都市一环路南 一段 24号四川大 学 (72)发明人 罗爱民　王颖　吴茗花　邱勇　 (74)专利代理 机构 成都中亚专利代理有限公司 51126 专利代理师 赵婷 (51)Int.Cl. C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/07(2006.01) (54)发明名称 用于鉴别大曲中解淀粉芽孢杆菌的引物、 试 剂盒及鉴别方法 (57)摘要 本发明属于白酒检测技术领域， 公开了用于 鉴别大曲中解淀粉芽孢杆菌的引物、 试剂盒及鉴 别方法。 用于鉴别大曲中解淀粉芽孢杆菌的引 物， 为一对特异性ARMS引物： ARMS ‑1F和ARMS ‑1R， 其核苷酸序列分别如SEQ  ID NO:1、 SEQ  ID NO:2 所示。 本发明利用qPCR技术， 建立了解淀粉芽孢 杆菌的ARMS ‑qPCR检测方法， 实现区分大曲中解 淀粉芽孢杆菌与其他近缘菌种， 经特异性、 检出 限验证， 表明利用本发明可快速、 准确地进行鉴 定， 且相较于传统形态学、 生理生化鉴定手段有 误差大、 效率低的缺点， 该方法具体有操作简便、 反应快速， 能实现精准的定性 鉴定。 权利要求书1页 说明书7页 序列表4页 附图2页 CN 114540519 A 2022.05.27 CN 114540519 A 1.用于鉴别大曲中解淀粉芽孢杆菌的引物， 其特征在于， 为一对特异性ARMS引物： ARMS‑1F和ARMS ‑1R， 其核苷酸序列分别如SEQ  ID NO:1、 SEQ ID NO:2所示。 2.如权利要求1所述的用于鉴别大曲中解淀粉芽孢杆菌的引物， 其特征在于， 所述ARMS 引物是使用PCR引物2 ‑F和2‑R扩增解淀粉芽孢杆菌后设计得到， 所述2 ‑F和2‑R的碱基序列 分别如SEQ  ID NO:3、 SEQ ID NO:4所示。 3.用于鉴别大曲中解淀粉芽孢杆菌的试剂盒， 其特征在于， 包含如权利要求1或2所述 的用于鉴别大曲中解淀粉芽孢杆菌的引物。 4.用于鉴别大曲中解淀粉芽孢杆菌的方法， 其特 征在于， 包 含以下步骤： 提取待测菌株 基因组DNA； 以待检测菌株基因组DNA为模板， 利用权利要求1或2所述的用于鉴别大曲中解淀粉芽 孢杆菌的引物进行实时荧光定量PCR方法进行定性分析， 根据扩增 循环数差值鉴别出大曲 中解淀粉芽孢杆菌 。 5.如权利要求4所述的用于鉴别大曲中解淀粉芽孢杆菌的方法， 其特征在于， 所述实时 荧光定量PCR方法反应程序为： 9 5℃预变性10  min； 95℃变性10  s， 60℃退火30  s， 75℃延伸 45s， 40个 循环， 在6 0℃收集荧光信号。 6.如权利要求4或5所述的用于鉴别大曲中解淀粉芽孢杆菌的方法， 其特征在于， 实时 荧光定量PCR反应体系为： 总体积2 0 μL， 包括qPCR Mix 10 μ L， 2.5  µmol/L、 0.8 μL的ARMS ‑1F 引物， 2.5  µmol/L、 0.8 μL的ARMS ‑1R 引物， 待测菌株 基因组DNA模板1 μL， d dH2O7.4uL。 7.如权利要求4所述的用于鉴别大曲中解淀粉芽孢杆菌的方法， 其特征在于， 所述待测 菌株包含解淀粉芽孢杆菌、 枯草芽孢杆菌、 地衣芽孢杆菌、 蜡样 芽孢杆菌、 苏云金芽孢杆菌、 嗜气芽孢杆菌、 不动芽孢杆菌和人参芽孢杆菌 。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114540519 A 2用于鉴别大曲中解淀 粉芽孢杆菌的引物、 试剂盒及鉴别方 法 技术领域 [0001]本发明属于白酒检测技术领域， 具体涉及用于鉴别大曲中解淀粉芽孢杆菌的引 物、 试剂盒及鉴别方法。 背景技术 [0002]四甲基吡嗪 （Tetr amethylpyr azine， TTMP） 又名川芎嗪， 属生物碱类， 是一种含氮 杂环化合物， 广泛存在于食品原料、 咖啡以及乳制品中， 具有烘烤香气、 甜香， 是中 国白酒中 的重要香气化合物之一。 近年来， 很多文 献报道了大曲中高产四甲基吡嗪菌株的筛选情况， 常见的高产四甲基吡嗪的菌株有地衣芽孢杆菌、 暹罗芽孢杆菌、 蛋白水解芽孢杆菌和解淀 粉芽孢杆菌等。 [0003]芽孢杆菌是大曲中高产四甲基吡嗪的主要菌株。 枯草芽孢杆菌、 地衣芽孢杆菌、 解 淀粉芽孢杆菌和萎缩芽孢杆菌等是近缘种。 区分解淀粉芽孢杆菌与其他菌株， 可以判断高 产四甲基吡嗪 的菌株在大曲中的生长情况。 [0004]传统的大曲中解淀粉芽孢杆菌的区分方法是微生物涂布平板法， 需要提取大曲样 品进行稀释涂布， 待平板长出菌落通过形态学观察来判断种类， 同时以生理生化实验辅助 来辨别菌种， 但芽孢杆菌近缘种在形态上难以区分， 且生理生化 实验复杂繁琐， 导致该方法 误差大且耗时。 [0005]鉴于此， 特提出本发明。 发明内容 [0006]为解决背景技术中的问题， 本发明的第一目的在于提供用于鉴别大曲中解淀粉芽 孢杆菌的引物， 该引物可以鉴别出 大曲中解淀粉芽孢杆菌与其 他近缘菌种。 [0007]本发明的第二目的在于提供用于鉴别大曲中解淀粉芽孢杆菌的试剂盒。 [0008]本发明的第三目的在于提供用于鉴别大曲中解淀粉芽孢杆菌 的方法。 能够快速、 准确地鉴别出解淀粉芽孢杆菌与其 他近缘菌种。 [0009]为达到上述目的， 本发明采用的第一个技 术方案为： 用于鉴别大曲中解淀粉芽孢杆菌的引物， 为一对特异性ARMS引物： ARMS ‑1F和 ARMS‑1R， 其核苷酸序列分别如SEQ  ID NO:1、 SEQ ID NO:2所示。 [0010]优选的， 所述ARMS引物 是使用PC R引物2‑F和2‑R扩增解淀粉芽孢杆菌后设计得到， 所述2‑F和2‑R的碱基序列分别如SEQ  ID NO:3、 SEQ ID NO:4所示。 [0011]本发明采用的第二个技 术方案为： 用于鉴别大曲中解淀粉芽孢杆菌的试剂盒， 包含第一个技术方案的用于鉴别大曲 中解淀粉芽孢杆菌的引物。 [0012]本发明采用的第三个技 术方案为： 用于鉴别大曲中解淀粉芽孢杆菌的方法， 包 含以下步骤： 提取待测菌株 基因组DNA；说　明　书 1/7 页 3 CN 114540519 A 3