(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210284883.8 (22)申请日 2022.03.22 (71)申请人 杭州医学院 地址 310000 浙江省杭州市西湖区天目山 路182号 (72)发明人 冯玲芳　陈钧强　蒋兆强　楼建林　 夏海玲　余珉　肖芸　张敏　 刘佳琪　 (74)专利代理 机构 成都宏田知识产权代理事务 所(普通合伙) 51337 专利代理师 常利敏 (51)Int.Cl. C12Q 1/6886(2018.01) C12Q 1/6883(2018.01) C12Q 1/6869(2018.01)C40B 50/06(2006.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种石棉相关疾病甲基化标记物的检测引 物组合、 试剂盒及扩增子测序文库的构建方法 (57)摘要 本发明提供了一种石棉相关疾病甲基化标 记物的引物组合、 试剂盒及其扩增子测序文库的 建立方法， 包括获取恶性间皮瘤病人、 石棉暴露 人群和健康对照人群样本全基因组DNA甲基化测 序数据、 筛选差异 甲基化片段/位点、 设计DNA 甲 基化扩增子测序文库构建的引物及扩增子文库 构建方法。 本发明采用全基因组DNA甲基化测序 数据筛选恶性间皮瘤和石棉暴露人群的甲基化 标记物， 利用高通量扩增子测序的方法对234个 样品、 50个特定甲基化区域进行联合检测， 提高 了恶性间皮瘤等石棉相关疾病甲基化标记物筛 选的可靠性与有效性， 筛选方法高效可行， 实现 了甲基化标记物 检测的高通量和高敏感性， 适用 于大样本多目标区域的验证， 可广泛应用于石棉 暴露人群的筛查。 权利要求书2页 说明书10页 序列表6页 附图2页 CN 114507737 A 2022.05.17 CN 114507737 A 1.一种石棉相关疾病甲基化标记物的检测引物组合， 其特征在于， 所述引物为针对目 标片段和位 点设计的 甲基化特异性引物组合。 2.如权利要求1所述的一种 石棉相关疾病甲基化标记物的检测引物组合， 其特征在于， 所述甲基化特异性引物组合如下表所示： 表1 试剂盒中包 含的DNA甲基化扩增子测序引物组合物 简并碱基： R代 表A/G， Y代表 C/T。 3.如权利要求2所述的一种 石棉相关疾病甲基化标记物的检测引物组合， 其特征在于， 所述甲基化检测引物检测的CpG位 点为下表所示的位 点 DMR_ID chr13_99408200 chr16_8918 8699 chr20_61601521 chr3_60499552 chr1_230187874_23 0187959 chr2_208377538 chrX_9480 080 。 4.一种试剂盒， 所述试剂盒包括如权利要求2或3中所述的 甲基化特异性引物组合。 5.如权利要求4所述的试剂 盒， 其特征在于， 所述试剂 盒还包括扩增目标片段和位点的 DNA甲基化 转化试剂和热启动高保真DNA聚合酶。 6.如权利要求5所述的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂包括核酸纯化试剂和DNA文库制 备试剂。 7.一种石棉相关疾病DNA甲基化扩增子测序文库的构建方法， 其特征在于， 包括如下步 骤： S1： 全基因 组DNA提取 S101、 选取石棉暴露大于等于10年的研究对象作为AE≥10y组， 选取恶性胸膜间皮瘤病 人作为MPM组， 选择年龄、 性别和吸烟饮酒史相匹配的对照人群作为Co ntrol组； S102、 采集上述三组研究对象的外周血样品， EDTA抗凝， 提取全基因组DNA并进行合格权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114507737 A 2性检测； S2： 设计DNA甲基化特异性引物 S201、 根据差异甲基化片段/位点使用软件Methyl  Primer Express  v1.0和 MethPrimer设计DNA甲基化特异性引物； S202、 并根据差异甲基化片段/位点在基因组上的位置信息和CG含量确定DNA甲基化扩 增子测序检测区域， 选择合 适的引物； S3： DNA甲基化扩增子测序 S301、 DNA甲基化扩增子测序的方法在上述筛 选的差异甲基化片段和位 点中进行验证； S302、 根据上述的差异甲基化片段和位点设计特异性甲基化引物组合， 并检测引物组 合是否设计成功； S303、 PCR扩增； S4： 质检。 8.如权利要求7所述的方法， 其特征在于， 所述步骤S303中检测引物成功后， 根据引物 所在基因位置， 挑取物理位置相差较远， 位置>3Kb的引物混合， 引物条数控制在20对内， 单 个引物的终浓度为5P， 通过PCR扩增进行目标区域的富 集。 9.如权利 要求8所述的方法， 其特征在于， 所述步骤S303中PCR扩增方法是所得到的PCR 产物进行混样， 对PCR产物进行末端修复、 加 “A”， 并进行Adapter连接， PCR扩增后， 纯化PCR 产物， 即得到DNA甲基化扩增子文库。 10.如权利 要求9所述的方法， 其特征在于， 步骤S303中PCR扩增条件为： 45个循环， 94℃ 扩增30s， 55℃扩增30s， 72℃扩增40s， 然后通过磁珠纯化分离目标区域即得到用于扩增子 测序的DNA文库。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114507737 A 3