(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210286587.1 (22)申请日 2022.03.22 (71)申请人 上海润达榕 嘉生物科技有限公司 地址 200439 上海市宝山区江杨南路8 80号 V077 (72)发明人 钱学庆　秦炜　 (74)专利代理 机构 北京品源专利代理有限公司 11332 专利代理师 王艳斋 (51)Int.Cl. C12Q 1/6858(2018.01) C12Q 1/6883(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种用于靶基因拷贝数检测的方法 (57)摘要 本发明提供一种用于靶基因拷贝数检测的 方法， 在同一反应中同时扩增待测样本的靶基因 和内参基因， 通过计算qPCR扩增曲线上两者的扩 增曲线ΔRn比值C(C＝ΔRn靶基因/ΔRn内参基因)确定 待测个体的靶基因拷贝数， 根据该比值的范围可 有效检测出靶基因的基因型。 权利要求书3页 说明书14页 附图3页 CN 114457144 A 2022.05.10 CN 114457144 A 1.一种检测靶基因拷贝数的方法， 所述方法包括： (1)提取样本DNA； (2)在同一反应中 同时对所述样本DNA中的靶基因和内参基因进行qPCR扩增， 分别获得 所述靶基因和内参基因的扩增曲线ΔRn 值； (3)靶基因拷贝数分析： 计算所述靶基因和内参基因的扩增曲线ΔRn值的比值C， 根据 比值C判断靶基因拷贝数。 2.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 所述靶基因为SMN1， 所述内参基因为 GAPDH； 优选地， 步骤(3)中， 扩增曲线ΔRn值的比值C的计算公式为： C＝ΔRn靶基因/ΔRn内参基因， 进 一步优选为： C＝ΔRnSMN1/ΔRnGAPDH， ； 优选地， 步骤(3)中， 判断靶基因拷贝数的标准包括： SMN1和内参基因GAPDH的扩增曲线ΔRn值的比值C为0.85～1.15， 则判断SMN1基因和内 参基因GAP DH均为2个 拷贝； SMN1和内参基因GAPDH的扩增曲线ΔRn值的比值C为0.3～0.7， 则判断SMN1基因的拷贝 数为1个拷贝， 内参基因GAP DH为2个拷贝； SMN1和内参基因GAPDH的扩增曲线ΔRn值 的比值C为 ‑0.1～0.1， 则判断SMN1基因的拷 贝数为零个拷贝。 3.根据权利 要求2所述的方法， 其特征在于， 步骤(2)具体包括如 下步骤： 将样本DNA、 检 测靶基因的引物探针组合和 检测内参基因的引物探针组合加入检测 体系PCR反应液中， 混 合， 得到PCR体系， 对PCR体系进行扩增， 分别获得所述靶基因和内参基因的扩增曲线ΔRn 值； 优选地， 所述检测靶基因的引物探针组合包括用于SMN1拷贝数检测的引物探针组合， 所述用于SMN1拷贝数检测的引物探针组合包括特异性扩增并检测SMN1的引物对和探针； 优选地， 所述特异性扩增SMN1的引物对 包括， 正向引物SEQ  ID No.1： TTTATTTTCCTTACAGGGTTTC； 反向引物SEQ  ID No.2： GCTG GCAGACTTACTCCTTA； 优选地， 所述检测SMN1的探针包括SEQ  ID No.3： AGAAGGAAGGTGCTCACATT所示的核苷酸 序列； 优选地， 所述检测内参基因的引物探针组合包括特异性扩增并检测内参基因GAPDH的 引物对和探针； 优选地， 所述特异性扩增内参基因GAP DH的引物对 包括， 正向引物SEQ  ID No.4： AAGGGCTTCGTATGACTG GG； 反向引物SEQ  ID No.5： CTCCCTTGAGCTTCCCTGC； 优选地， 所述检测内参基 因GAPDH的探针包括SEQ  ID No.6： TTGGGCAGCCCTGGA所示的核 苷酸序列； 优选地， 所述探针的5 ’端修饰荧 光染料， 所述探针的3 ’端修饰淬灭剂； 优选地， 所述探针的3 ’端还连接 了MGB基团。 4.根据权利要求3所述的方法， 其特 征在于， 所述样本DNA的浓度为5～10 0ng/ μL； 优选地， 所述PCR体系中特异性扩增SMN1的正向引物和反向引物的终浓度各自独立的权　利　要　求　书 1/3 页 2 CN 114457144 A 2为0.1～1 μM； 优选地， 所述PCR体系中特异性扩增所述 内参基因GAPDH的正向引物和反向引物的终浓 度各自独立的为0.1～1 μM； 优选地， 所述PCR体系中检测 SMN1的探针和检测内参基因GAPDH的探针的终浓度各自独 立的为0.1～1 μM； 优选地， 所述PCR体系中dNTP的终浓度为80～1.0 μM； 优选地， 所述PCR体系中DNA聚合酶的终浓度为0.02 ～0.1U/ μL。 5.根据权利要求2 ‑4任一项所述的方法， 其特征在于， 所述方法还包括使用质控试剂进 行同步检测的步骤； 优选地， 所述使用方法还 包括判断SMN1基因的缺失情况的步骤； 所述判断SMN1基因的缺失情况的标准包括： SMN1基因和内参基因GAP DH均为2个 拷贝， 所述SMN1基因为野生型； SMN1基因的拷贝数为1个拷贝， 内参基因GAPDH为2个拷贝， 所述SMN1基因为杂合缺失 型； SMN1基因的拷贝数为 零个拷贝， SMN1无扩增产物， 所述SMN1基因为纯合 缺失型。 6.一种用于靶基因拷贝数检测的试剂盒， 其包括权利要求3 ‑5中任一项所述的检测靶 基因的引物探针组合和检测内参基因的引物探针组合， 以及反应试剂和质控试剂。 7.根据权利要求6所述的试剂盒， 其特征在于， 所述反应试剂包括样本DNA抽提试剂和 检测体系PCR反应液； 优选地， 所述检测体系PCR反应液包括DNA聚合酶、 酶 缓冲液、 MgCl2和dNTPs； 优选地， 所述质控试剂包括SMN1零拷贝质控品、 SMN1单拷贝质控品或SMN1两拷贝质控 品； 优选地， 所述SMN1零拷贝质控品为含有两拷贝内参基因GAP DH的质粒； 优选地， 所述SMN1单拷贝质控品为含有单拷贝SMN1基因和两拷贝内参基因GAPDH 的质 粒； 优选地， 所述SMN1两拷贝质控品为含有两拷贝SMN1基因和两拷贝内参基因GAPDH 的质 粒。 8.根据权利要求6或7所述的试剂盒以非疾病诊断和/或治疗为目的的使用方法， 包括 以下步骤： (1)采集并处理样本DNA， 将样本DNA、 用于SMN1、 内参基因GAPDH拷贝数检测的引物探针 组合加入检测体系PCR反应液中， 混合， 得到P CR体系； 所述PCR体系中所述样 本DNA的浓度为 5～100ng/ μL， 特异性扩增SMN1的正向引物和反向引物的终浓度各自独立的为0.1～1 μM， 特 异性扩增所述内参基因GAPDH的正向引物和反向引物的终浓度各自独立的为0.1～1μM， 检 测SMN1的探针和检测内参基因GAPDH的探针的终浓度各自独立的为0.1～1 μM， 所述PCR体系 中dNTP的终浓度为80～1.0 μM， 所述PCR体系中DNA聚合酶的终浓度为0.02 ～0.1U/ μL； 使用质控试剂进行同步检测； (2)对PCR体系进行扩增， 获得SMN1和GAP DH的扩增曲线； 所述PCR扩增的程序包括： 预变性： 93～ 96℃孵育3～7min；权　利　要　求　书 2/3 页 3 CN 114457144 A 3