(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210285344.6 (22)申请日 2022.03.22 (71)申请人 日照市海 洋与渔业研究院 （日照市 海域使用动态监视监测中心、 日照 市水生野生动物救护站） 地址 276826 山 东省日照市山海天旅游度 假区碧海路8 8号 (72)发明人 陈晓玲　王君霞　季本安　许传堂　 韩涛　于为民　于盟盟　 (74)专利代理 机构 北京开阳星知识产权代理有 限公司 1 1710 专利代理师 李玉宾 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/6893(2018.01)C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种用于同时检测虾 肝肠胞虫、 十足目虹彩 病毒1的双重PCR检测方法及试剂盒 (57)摘要 本发明属于属于海洋生物病原检测技术领 域， 具体涉及一种用于同时检测虾肝肠胞虫、 十 足目虹彩病毒1的双重PCR检测方法及试剂盒。 本 发明提供了一种用于同时检测虾 肝肠胞虫、 十足 目虹彩病毒1的双重PCR检测方法， 所使用的PCR 引物如SEQ  ID NO:1、 SEQ  ID NO:2所示， 本发明 对检测的病原 基因片段无需再进行克隆、 测序和 序列比对。 一次实验即可检测出待测样品中是否 含有这2种病原中的一种或两种。 克服了以往单 一检测的操作繁琐、 灵敏度低、 适用性低等诸多 限制。 权利要求书2页 说明书6页 附图1页 CN 114717358 A 2022.07.08 CN 114717358 A 1.一种用于同时检测虾肝肠胞虫、 十足目虹彩病 毒1的双重PCR检测方法， 其特征在于： 所使用的PCR引物如下： 虾肝肠胞 虫EHP 上游引物： E HP‑F： GAGAGTAGCG GAACGGATAG          SEQ ID NO:1 下游引物： E HP‑R： GCATCACG GACCTGTTATTG          SEQ ID NO:2 十足目虹彩病毒1DIV1 上游引物： DIV1 ‑F： GGGCGGGAGATGGTGTTAGAT        SEQ ID NO:3 下游引物： DIV1 ‑R： TCGTTTCGGTACGAAGATGTA        SEQ ID NO:4。 2.根据权利要求1所述的一种用于同时检测虾肝肠胞虫、 十足目虹彩病毒1的双重PCR 检测方法， 其特 征在于包括以下步骤： (1)提取DNA； (2)采用权利要求1所述引物SEQ  ID NO:1、 SEQ  ID NO:2、 SEQ  ID NO:3、 SEQ  ID NO:4进 行PCR扩增； (3)结果判定 。 3.根据权利要求2所述的一种用于同时检测虾肝肠胞虫、 十足目虹彩病毒1的双重PCR 检测方法， 其特征在于： 将核酸序列SEQ  ID NO:5、 SEQ  ID NO:6混合作为模板成立阳性对照 组， 将不含有对虾肝肠胞虫、 十足目虹彩病毒1任一病毒的任意DNA核酸序列作为模板成立 阴性对照组。 4.根据权利要求3所述的一种用于同时检测虾肝肠胞虫、 十足目虹彩病毒1的双重PCR 检测方法， 其特征在于： 当检测样本和阳性对照的扩增条带大小接近， 约为512bp时， 结果为 虾肝肠胞虫阳性； 如果没有512bp条带， 则为虾肝肠胞虫阴性； 当检测样本和阳性对照的扩 增条带大小接近， 约为457bp时， 结果为十足目虹彩病毒1阳性； 如果没有457bp条带， 则为十 足目虹彩病毒1阴性。 5.根据权利要求2 ‑4任一所述的一种用于同时检测虾肝肠胞虫、 十足 目虹彩病毒1的双 重PCR检测方法， 其特征在于： 步骤(2)中所述PCR扩增的反应体系为： 50 μL， 反应体系中包含 有10倍浓度的含镁离子的TaqDNA聚合酶缓冲液5μL， Taq  DNA聚合酶1μL， 各引物终浓度为 0.4 μM， 提取好待检测的DNA模板2 μL。 6.根据权利要求5所述的一种用于同时检测虾肝肠胞虫、 十足目虹彩病毒1的双重PCR 检测方法， 其特征在于： PCR反应条件为： 95℃4分钟， 1个循环； 95℃1秒， 58.5℃1分钟， 72℃1 分钟， 35个循环； 72℃10分钟， 1个 循环； 4℃保存。 7.一种用于同时检测虾肝肠胞虫、 十足目虹彩病毒1的双重PCR检测引物， 其特征在于 引物序列如下： 虾肝肠胞 虫EHP 上游引物： E HP‑F： GAGAGTAGCG GAACGGATAG          SEQ ID NO:1 下游引物： E HP‑R： GCATCACG GACCTGTTATTG          SEQ ID NO:2 十足目虹彩病毒1DIV1 上游引物： DIV1 ‑F： GGGCGGGAGATGGTGTTAGAT        SEQ ID NO:3 下游引物： DIV1 ‑R： TCGTTTCGGTACGAAGATGTA        SEQ ID NO:4。 8.一种用于同时检测虾肝肠胞虫、 十足目虹彩病毒1的双重PCR检测试剂盒， 其特征在权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114717358 A 2于包含以下PCR扩增引物： 虾肝肠胞 虫EHP 上游引物： E HP‑F： GAGAGTAGCG GAACGGATAG          SEQ ID NO:1 下游引物： E HP‑R： GCATCACG GACCTGTTATTG          SEQ ID NO:2 十足目虹彩病毒1DIV1 上游引物： DIV1 ‑F： GGGCGGGAGATGGTGTTAGAT        SEQ ID NO:3 下游引物： DIV1 ‑R： TCGTTTCGGTACGAAGATGTA        SEQ ID NO:4。 9.根据权利要求8所述的一种同时检测虾肝肠胞虫、 十足目虹彩病毒1的双重PCR检测 试剂盒， 其特征在于： 包含以核酸序列SEQ  ID NO:5、 SEQ  ID NO:6混合作为模板的阳性对照 组及以不含有对虾肝肠胞虫、 十足目虹彩病毒1任一病毒的任意DNA核酸序列作为模板的阴 性对照组。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114717358 A 3