(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210293711.7 (22)申请日 2022.03.23 (71)申请人 北京盛因生物科技有限公司 地址 100176 北京市大兴区经济技 术开发 区文化园西路8号院1号楼15层1810A (72)发明人 不公告发明人 　 (74)专利代理 机构 北京三聚阳光知识产权代理 有限公司 1 1250 专利代理师 张均莹 (51)Int.Cl. C12Q 1/6876(2018.01) C12N 9/12(2006.01) C12N 9/22(2006.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/113(2010.01)C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种等温核酸检测酶组合物、 试剂盒及其用 途和检测方法 (57)摘要 本发明涉及核酸检测领域， 具体涉及一种等 温核酸检测酶组合物、 试剂盒及其用途和检测方 法。 本发明提供的一种等温核酸检测的酶组合 物， 所述酶组合物包括重组酶、 单链结合蛋白、 DNA聚合酶、 重组酶辅助蛋白和Cas14a蛋白； 利用 所述酶组合物进行等温核酸检测时， 无需对扩增 产物进行单链 化处理， 实现对目的片段的一步法 扩增及检测。 权利要求书3页 说明书10页 序列表9页 附图6页 CN 114561456 A 2022.05.31 CN 114561456 A 1.一种等温核酸检测的酶组合物， 其特征在于， 所述酶组合物包括重组酶、 单链结合蛋 白、 DNA聚合酶、 重组酶辅助蛋白和Cas14a 蛋白。 2.根据权利要求1所述的等温核酸检测的酶组合物， 其特征在于， 所述的重组酶包括 UvsX蛋白； 可选的， 所述UvsX蛋白包括T4  UvsX、 T6 UvsX或Rb69  UvsX； 或 所述单链结合蛋白包括GP32蛋白； 可选的， 所述GP32蛋白包括T4  GP32、 T6 GP32或Rb69   GP32； 或 所述DNA聚合酶包括链置换DNA聚合酶； 可选的， 所述链置换DNA聚合酶包括金黄色葡萄 球菌的DNA聚合 酶I的大片段、 枯草芽孢杆菌DNA聚合 酶I大片段或大肠杆菌DNA聚合 酶I大片 段； 或 所述重组酶辅助蛋白包括UvsY蛋白； 可选的， 所述UvsY蛋白包括T4  UvsY、 T6 UvsY或 Rb69 UvsY。 3.根据权利要求1或2所述的等温核酸检测的酶组合物， 其特征在于， 所述UvsX蛋白为 如下A1)‑A2)中任意 一种： A1)氨基酸序列如SEQ  ID NO:9所示； A2)如SEQ  ID NO:9所示的氨基酸序列的任意一个或几个氨基酸残基经过一个或几个 氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与 A1)所示的氨基酸序列具有90％以上的同 一性的蛋白； 和/或， 所述UvsY蛋白为如下B1) ‑B2)中任意 一种： B1)氨基酸序列如SEQ  ID NO:10所示； B2)如SEQ  ID NO:10所示的氨基酸序列的任意一个或几个氨基酸残基经过一个或几个 氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与B1)所示的蛋白具有90％以上的同一性的 蛋白； 和/或， 单链结合蛋白GP32为如下C1) ‑C2)中任意 一种： C1)氨基酸序列如SEQ  ID NO:11所示； C2)如SEQ  ID NO:11所示的氨基酸序列的任意一个或几个氨基酸残基经过一个或几个 氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与C1)所示的蛋白具有90％以上的同一性的 蛋白； 和/或， 所述Cas14a 蛋白为如下D1) ‑D2)中任意 一种： D1)氨基酸序列如SEQ  ID NO:12所示； D2)如SEQ  ID NO:12所示的氨基酸序列的任意一个或几个氨基酸残基经过一个或几个 氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与D1)所示的蛋白具有90％以上的同一性的 蛋白。 4.根据权利要求1 ‑3任一项所述的等温核酸检测的酶组合物， 其特征在于， 所述酶组合 物中， 重组酶、 重组酶辅助蛋白、 单链结合蛋白、 链置换DNA聚合 酶和Cas14a蛋白的质量比为 1： (0.2‑4.6)： (0.7 7‑2.3)： (0.2 ‑0.8)： (0.1 ‑1.5)； 可选的， 所述酶组合物为液态混合物或冻干粉混合物。权　利　要　求　书 1/3 页 2 CN 114561456 A 25.一种等温核酸检测试剂 盒， 其特征在于， 包括权利要求1 ‑4任一项所述的等温核酸检 测的酶组合物； 可选的， 还 包括扩增缓冲液、 报告分子和反应启动剂中的至少一种； 可选的， 所述等温核酸检测试剂盒中， 分为独立包装的三部分， 第一部分为包括酶组合 物、 扩增缓冲液和报告分子的冻干粉， 第二部分为反应缓冲液， 第三部分为反应启动剂； 所 述反应缓冲液中含有缓冲液、 醋酸盐或拥挤试剂中的至少一种； 可选的， 所述扩增缓冲液中含有dNTPs、 ATP、 缓冲液、 磷酸肌酸、 肌酸激酶、 dNTPs、 醋酸 盐或拥挤试剂中的至少一种； 可选的， 所述缓冲液包括Tris缓冲液、 H EPES缓冲液或MOP S缓冲液； 可选的， 所述醋酸盐包括醋酸钾或醋酸钠； 可选的， 所述拥挤试剂包括聚乙二醇、 聚乙烯醇、 聚氧化乙烯、 葡聚糖或聚蔗糖； 可选的， 所述拥挤试剂为平均分子量范围为80 00‑35000的聚乙二醇； 可选的， 所述拥挤试剂为平均分子量 为35000的聚乙二醇。 6.根据权利要求5所述的等温核酸检测试剂盒， 其特 征在于， 所述报告分子为单链DNA， 所述单链DNA的一端修饰荧 光基团， 另一端修饰猝灭基团； 可选的， 所述单链DNA5 ’修饰荧光基团F， 3 ’修饰猝灭基团Q； 可选的， 所述报告分子为： 5 ’ ‑F‑TTTTTTTTTTTT‑Q‑3’； 可选的， 所述 荧光基团F为FAM、 H EX、 TET、 JOE或VIC， 猝灭基团Q 为BHQ1、 BHQ2或BHQ3 。 7.根据权利要求5或6所述的等温核酸检测试剂盒， 其特征在于， 所述反应启动剂为含 Mg2+的溶液； 可选的， 所述反应启动剂为醋酸镁溶 液或氯化镁溶 液； 可选的， 还 包括： 针对待测核酸设计的正向引物和反向引物； 和/或 针对待测核酸的sgRNA； 可选的， 待测核酸 为DNA或RNA； 可选的， 所述DNA为双链DNA或单链DNA； 可选的， 待测核酸为RNA时， 所述酶组合物中还包括逆转录酶； 可选的， 所述逆转录酶为 M‑MLV逆转录酶。 8.根据权利要求5 ‑7任一项所述的等温核酸检测试剂盒， 其特征在于， 利用所述的等温 核酸检测试剂盒配制的等温核酸检测反应体系， 按50μL反应体系计， 包括如下终浓度的组 分： 引物： 正向引物和反向引物的浓度各为3 00‑500nM； sgRNA： 浓度为5 0‑200nM； 所述酶组合物： 重组酶、 重组酶辅助蛋白、 单链结合 蛋白、 链置换DNA聚合酶和Cas14a蛋 白的质量比为1： (0.2 ‑4.6)： (0.77 ‑2.3)： (0.2 ‑0.8)： (0.1 ‑1.5)； 其中， 重组酶2 00‑500ng/ μ L； 所述扩增缓冲液： dNTPs中每种碱基的浓度均为150 ‑300μM、 ATP为1 ‑5mM、 醋酸钾为60 ‑ 100mM、 Tris缓冲液为30 ‑100mM、 磷酸肌酸为50 ‑100mM， 肌酸激酶50 ‑100ng/μL， 聚乙二醇 35000 5‑8％w/v； 所述报告分子浓度为10 0‑500nM； 所述反应启动剂浓度为10mM ‑30mM； 可选的， 包括如下终浓度的组分：权　利　要　求　书 2/3 页 3 CN 114561456 A 3