(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210293190.5 (22)申请日 2022.03.23 (71)申请人 厦门飞朔生物技 术有限公司 地址 361100 福建省厦门市同安区西柯镇 西洲路2041号四层401单 元 (72)发明人 陈琰　郭飞飞　康灿昆　陈志宏　 (74)专利代理 机构 深圳市兰锋盛世知识产权代 理有限公司 4 4504 专利代理师 罗炳锋 (51)Int.Cl. C12Q 1/6886(2018.01) C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01) G01N 21/76(2006.01) (54)发明名称 一种基于转录组的肿瘤转移基因检测方法 (57)摘要 本发明涉及肿瘤转移基因检测技术领域， 尤 其为一种基于转录组的肿瘤转移 基因检测方法， 包括以下步骤： S1， 细胞培养及脱甲基化处理； S2， 肿瘤细胞的形态学观察； S3， 基因组DNA的亚 硫酸氢盐的修饰； S4， 甲基化特异性PCR(MSP)； S5， RT‑PCR检测基因表 达水水平； S6， 化学 发光法 定量检测肿瘤细胞脱甲基化处理前后基因甲基 化程度； S7， 利用凝胶成像分析系 统对RT‑PCR结 果进行检测图像分析； 通过用RT ‑PCR检测瘤细胞 P16基因的表达， 肿瘤细胞在用5 ‑Aza‑CdR处理后 比处理前P16基因表达有了显著升高， 甲基化程 度的高低与转录产物呈明显的逆相关， 同时形态 学观察上也发现用5 ‑Aza‑CdR处理后通过脱甲基 化使细胞增殖明显减缓， 倍增时间明显延长， 使 肿瘤转移基因检测的检测效果更好。 权利要求书2页 说明书5页 CN 114672563 A 2022.06.28 CN 114672563 A 1.一种基于转录组的肿瘤转移基因检测方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： S1， 细胞培 养及脱甲基化处 理； S2， 肿瘤细胞的形态学观察； S3， 基因组DNA的亚硫酸氢盐的修饰； S4， 甲基化特异性PCR(MS P)； S5， RT‑PCR检测基因表达水 水平； S6， 化学发光法定量检测肿瘤 细胞脱甲基化处 理前后基因甲基化 程度； S7， 利用凝胶成像分析系统对RT ‑PCR结果进行检测图像分析。 2.根据权利要求1所述的一种基于转录组的肿瘤转移基因检测方法， 其特征在于， 所述 S1用含10％小牛血清培养液37℃、 5％CO2培养癌细胞株， 取约3x105个细胞置入直径为100mm 的培养皿中用去甲基 化试剂处理(终浓度为10‑6M)， 24小时后更换培养液， 以后每3天更换一 次培养液， 9天后收获细胞， 用Trizol总RNA提取试剂盒提取DNA和RNA， 以甲醛凝胶电泳和 A260/A280比值判断提取RNA的完整性及纯度。 3.根据权利要求1所述的一种基于转录组的肿瘤转移基因检测方法， 其特征在于， 所述 S2用倒置 显微镜对5 ‑Aza‑CdR处理前后的肿瘤 细胞观察。 4.根据权利要求1所述的一种基于转录组的肿瘤转移基因检测方法， 其特征在于， 所述 S3取1～2ug基因组DNA， 加入双蒸水至50 μl， 用NaOH(终浓度为0.2mol/L)37℃变性10min， 向 变性后的DNA中加入520 μl新鲜配制的亚硫酸氧钠(pH5.0)和30 μl新鲜配制的氢上面覆盖石 蜡油， 50℃水浴16h， 修饰后的DNA用Wizard  DNA纯化试剂盒纯化溶解于50 μl的双蒸水中， 再 加入NaOH(终浓度0.3mol/L)室温下放置5min， 最后用乙醇沉淀DNA， 并以适量的双 蒸水重新 溶解经亚硫酸氢钠修饰过的DNA， ‑20℃贮存备用。 5.根据权利要求1所述的一种基于转录组的肿瘤转移基因检测方法， 其特征在于， 所述 S4单链DNA的胞嘧啶可被亚硫酸氢盐脱氨基转变为尿嘧啶， 而5 ‑甲基胞嘧啶则不能被修饰， 仍保持为5 ‑甲基胞嘧啶， 根据5 ‑甲基胞嘧啶与胞嘧啶修饰后的不同， 设计甲基化和非甲基 化等位基因特异的引物， PCR扩增， 2％的琼脂糖凝胶电泳检测； PCR反应: 反应总体积50μl,包括经亚硫酸氢钠修饰后的模板DNA约50ng， 引物各300ng, dNT1.25mmol/L， 1.2 5 μlDNA聚合酶， 缓冲液(16.6mmol/L硫 酸铵、 67mmol/L Tris‑HclPH8.8、 10mmol/L  2‑巯基乙醇、 67mmol/LMgCl2)反应条件为95℃热启动15min,然后于95℃、 30s、 60 ℃、 30s、 72℃、 30s各循环35次， 最后于72℃延伸10min， 同时以正常人外周血淋巴细胞(PBL) DNA作为阴性对照， 以水作为空白对照， 取扩增产 物于2％琼脂糖凝胶中电泳， 凝胶成像系统 观察， 拍照。 6.根据权利要求1所述的一种基于转录组的肿瘤转移基因检测方法， 其特征在于， 所述 S5Trizol试剂一步法提取经5 ‑Aza‑CdR处理和未经5 ‑Aza‑CdR处理过细胞总RNA， 紫外分光 光度计测其浓度和纯度， 取2ug总RNA用M ‑MLV逆转录酶进行逆转录， 再以cDNA为模板扩增 P16基因， 并同时扩增β ‑actin为内参； PCR反应条件为： 94℃变性6min， 94℃、 1min、 62℃、 30s、 72℃、 50s， 34个循环， 72℃延伸 7min， 取扩增产物于2％琼脂糖凝胶中电泳， 凝胶成像系统观察， 拍照。 7.根据权利要求1所述的一种基于转录组的肿瘤转移基因检测方法， 其特征在于， 所述权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114672563 A 2S6反应总 体积50 μl， 包括经NaHSO3修饰的模板DNA约50ng， 各引物300ng， dNTP为0.25mmol/ L， 缓冲液， 扩增参数： 9 5℃热启动10分钟， 加入1.0UTaqDNA聚合酶然后于95℃、 60℃、 72℃各 30s循环30 次最后于72℃延伸6分钟； 同时以正常人外周血淋巴细胞(PBL)DNA作阴性对照， 以重蒸水作空白对照， 以Ss sI处理的正常人外周血白细胞DNA作为阳性对照； 取上述PCR扩增产物两份， 每份5μl， 分别加入两种检测探针各1.5pmol,补充杂交缓冲 液至终体积30 μl， 混匀， 95℃变性10min， 冷却至50℃， 取20 μl加入到链霉亲和素包被(4mg/ L， 4℃包被过夜)的发光管中， 补充杂交缓冲液至终体积200 μl， 48℃温育40min， 倾去杂交缓 冲液， 用洗涤缓冲液(PBS)于48℃及室温各洗涤两次， 然后加入200 μl抗 ‑地高辛‑过氧化物 酶复合物， 25℃温育40min， PBS洗涤5 次， 加入2004发光检测底物， 静置2min,用超弱发光检 测仪测定 6s发光积分值， 同时测定空白管， 甲基化百分率 ＝R/(Rm+Ru)X10 0％； Rm： 甲基化PCR产物的相对发值； R： 非甲基化PCR产物的相对发值。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114672563 A 3