(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210303117.1 (22)申请日 2022.03.24 (71)申请人 国家烟草质量 监督检验中心 地址 450001 河南省郑州市高新 技术产业 开发区翠竹街6号6幢、 7幢 (72)发明人 刘楠　张威　何声宝　冯晓民　 王英元　罗安娜　张晓慧　范月月　 (74)专利代理 机构 郑州睿信知识产权代理有限 公司 41119 专利代理师 郭佳效 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种判定烟草成分来源的方法 (57)摘要 本发明涉及一种判定烟草 成分来源的方法， 属于分子生物学领域。 该方法包括以下步骤： ① 根据烟草特有的SSR ‑1标记设计引物； 提取待测 样品的DNA， 用所述引物对所述DNA进行PCR扩增， 得到第一扩增产物， 电泳分析后确定是否存在烟 草物种的特异性条带； 如存在， 则待测样品中含 有烟草成分；②对含有烟草 成分的待测样品进行 洗脱， 提取洗脱后的待测样品的DNA， 用所述引物 对洗脱后的待测样品DNA进行PCR扩增， 得到第二 扩增产物， 电泳分析后确定是否存在烟草物种的 特异性条带， 如存在， 则烟草 成分是内源的； 所述 洗脱所用洗脱液为1.0～2.0mol/L的NaCl溶液。 该方法既能判断待测样品是否为烟草， 又能鉴定 该成分的来源。 权利要求书1页 说明书4页 序列表1页 附图1页 CN 114736982 A 2022.07.12 CN 114736982 A 1.一种判定烟草成分来源的方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： (1)根据烟草特有的SSR ‑1标记设计引物； 提取待测样品的DNA， 用所述引物对所述DNA 进行PCR扩增， 得到第一扩增产物， 对第一扩增产物进行电泳分析， 确定是否存在烟草物种 的特异性条 带； 如存在所述特异性条 带， 表明待测样品中含有烟草成分； (2)对含有烟草成分的待测样品进行洗脱， 提取洗脱后的待测样品的DNA， 用所述引物 对洗脱后的待测样品DNA进 行PCR扩增， 得到第二扩增产 物， 对第二扩增产 物进行电泳分析， 确定是否存在 烟草物种的特异性条 带； 所述洗脱所用洗脱液为1.0～ 2.0mol/L的NaCl溶 液； 如存在所述特异性条 带， 表明烟草成分是内源的； 如不存在， 表明烟草成分是外源的。 2.根据权利要求1所述的判定烟草成分来源的方法， 其特征在于， 步骤(1)和步骤(2) 中， 进行所述PCR扩增的上游引物如SEQ  ID NO： 1所示， 下游引物如SEQ  ID NO： 2所示。 3.根据权利要求1所述的判定烟草成分来源的方法， 其特征在于， 采用所述NaCl溶液对 待测样品洗脱3～5次。 4.根据权利要求3所述的判定烟草成分来源的方法， 其特征在于， 每0.1g待测样品对应 采用2mL的所述 NaCl溶液。 5.根据权利要求1所述的判定烟草成分来源的方法， 其特征在于， 所述PCR扩增的反应 体系包括20.8 μL的H2O、 3 μL的10 ×PCR缓冲液、 1μL的5 ′ ‑引物、 1μL的3 ′ ‑引物、 2 μL的dNTPs、 0.2 μL的Taq酶和2 μL的模板 。 6.根据权利要求1所述的判定烟草成分来源的方法， 其特征在于， 所述PCR扩增的反应 程序为： 94℃变性5 0s， 55℃复性3 0s， 72℃延伸3 0s， 重复3 5个循环。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114736982 A 2一种判定 烟草成分来源的方 法 技术领域 [0001]本发明属于分子生物学研究领域， 具体涉及一种 判定烟草成分来源的方法。 背景技术 [0002]烟丝很难从外观上进行鉴别检验， 而以烟草特有的亚硝胺、 烟碱等化学成分检测 来对烟丝进行检验又有如下局限： 其一， 烟碱并非烟草所独有， 在其它茄科植物中也很常 见； 其二， 化学成分检测易被不法分子所采取的非法加料等手段所干扰。 除此之外， 上述法 规要求检验人员不仅需要掌握相关的原料特性、 化学成分分析方法、 感官评吸技术， 还具备 烟叶生产和分级技能， 致使检验人员的培训难度大； 另外， 烟丝本身的霉变和不法分子所采 取的染色等手段， 也加大了检验 人员进行准确鉴定的难度。 因此， 依靠现有的检验方法对烟 丝进行鉴别， 容 易引起误判、 错判的发生。 [0003]申请公布号为CN104962648A的中国专利申请公开了一种应用FMYYSSR ‑1分子标记 技术鉴定烟草原料的方法， 在以十六烷基三甲基 溴化铵(CTAB)法， 对 各个样品的DNA进行提 取后， 以本发明所设计的引物对其进行PCR扩增， 经过电泳分析后， 确定烟草物种的特异性 条带位置， 视待测样品在相应位置有无扩增条 带产生来判断该样品是否为烟草。 [0004]在烟草及烟草制品的鉴定过程中， 不仅需要鉴定样品是否是烟草， 还要判定烟草 成分是否为外源 添加。 外源 添加例如在非烟基质(茶叶、 树叶等)上添加烟草成分(如烟草提 取液)混合， 以充当烟草制品。 内源烟草指样品本身即为烟草。 [0005]烟草成分是否是外源添加的判定是必要环节也是难点。 传统的外观和评吸鉴定方 法很难判定烟草成分的来源， 这对目前的烟草及 烟草制品的鉴别检验工作造成了困扰。 [0006]而上述文献(CN104962648A)记载的技术方案只能判定样品中是否含有烟草成分， 并不能进一 步判定烟草成分为内源 还是外源添加。 发明内容 [0007]本发明的目的在于提供一种判定烟草成分来源的方法， 该方法能够鉴定烟草成分 的来源。 [0008]为了实现上述目的， 本发明所采用的技 术方案为： [0009]一种判定烟草成分来源的方法， 包括以下步骤： [0010](1)根据烟草特有的SSR ‑1标记设计引物； 提取待测样品的D NA， 用所述引物对所述 DNA进行P CR扩增， 得到第一扩增产物， 对第一扩增产物进 行电泳分析， 确定是否存在烟草物 种的特异性条 带； 如存在所述特异性条 带， 表明待测样品中含有烟草成分； [0011](2)对含有烟草成分的待测样品进行洗脱， 提取洗脱后的待测样品的DNA， 用所述 引物对洗脱后的待测样品DNA进行PCR扩增， 得到第二扩增产物， 对第二扩增产物进行电泳 分析， 确定是否存在烟草物种的特异性条带； 所述洗脱所用洗脱液为1.0～2.0mol/L的NaCl 溶液； [0012]如存在所述特异性条带， 表明烟草成分是内源的； 如不存在， 表明烟草成分是外源说　明　书 1/4 页 3 CN 114736982 A 3